TRPV1介導(dǎo)大鼠神經(jīng)病理性疼痛的脊髓機(jī)制.pdf

1、背景：
　　神經(jīng)病理性疼痛是由神經(jīng)系統(tǒng)的損害或功能紊亂引起的一種常見(jiàn)而特殊的慢性疼痛，以自發(fā)性疼痛、痛覺(jué)過(guò)敏和觸誘發(fā)痛為特征。神經(jīng)病理性疼痛在成年人群的患病率約為5％-25％。神經(jīng)病理性疼痛不僅給機(jī)體帶來(lái)了極大的痛苦和負(fù)擔(dān)，同時(shí)也導(dǎo)致了勞動(dòng)能力的受限，工作效率的降低。但是，由于神經(jīng)病理性疼痛病因多樣，機(jī)制復(fù)雜，治療仍然相當(dāng)困難。據(jù)估計(jì)，只有不到半數(shù)的患者能得到50％以上程度的疼痛緩解。因此，研究和治療神經(jīng)病理性疼痛，對(duì)于提高人群生

2、活質(zhì)量，具有重要意義。
　　N-甲基-D-天門(mén)冬氨酸(NMDA)受體是谷氨酸受體的一個(gè)亞型，是一種配體門(mén)控型離子通道，在哺乳動(dòng)物的神經(jīng)系統(tǒng)具有廣泛的分布。NR2B是NMDA受體的其中一個(gè)亞基，對(duì)NMDA受體藥理和功能特性起決定性作用。突觸后致密物(PSD)是存在于谷氨酸能突觸后膜中的一種特殊結(jié)構(gòu)，其中一種95 kDa的蛋白質(zhì)——PSD-95，被發(fā)現(xiàn)與突觸可塑性以及神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生，具有密切的關(guān)系。
　　瞬時(shí)感受器電位香草

3、酸受體1（transient receptor potential vanilloid1，TRPV1）屬于瞬時(shí)感受器電位（transient receptor potential，TRP）超家族的成員，主要表達(dá)在初級(jí)傳入感覺(jué)神經(jīng)元上，是一種非選擇性的陽(yáng)離子通道。TRPV1作為一種與痛覺(jué)密切相關(guān)的離子通道型受體，在疼痛信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮著重要作用。近幾年對(duì)TRPV1的研究取得了較大進(jìn)展，在神經(jīng)病理性疼痛中的作用也越來(lái)越受到重視，但是目前為止，

4、仍缺乏相關(guān)蛋白質(zhì)水平的研究。本課題的開(kāi)展和順利完成可為神經(jīng)病理性疼痛的機(jī)制和治療研究提供新的思路和方向。
　　研究目的：
　　本研究擬采用藥理學(xué)手段，RNA干擾技術(shù)，形態(tài)學(xué)和行為學(xué)手段，在大鼠坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷（Chronic Constriction Injury，CCI）模型上，探討TRPV1在神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生發(fā)展中的作用及其調(diào)制機(jī)制，為慢性疼痛的防治提供理論依據(jù)。
　　究方法：
　　1.雄性Wista

5、r成年大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham組）和CCI組，測(cè)定各組大鼠機(jī)械痛閾和熱痛閾基礎(chǔ)值后，參考Bennett和Xie等的方法建立大鼠左側(cè)CCI模型。 Sham組進(jìn)行同樣的手術(shù)，暴露坐骨神經(jīng)但不結(jié)扎。分別于術(shù)后1、2、3、4、5、6、7、10、14、21、28天測(cè)定各組大鼠的機(jī)械痛閾和熱痛閾。模型動(dòng)物在深麻醉下處死，取腰膨大段脊髓背角組織，采用免疫印跡(Westernblot)方法檢測(cè)TRPV1、NR2B的表達(dá)，并用免疫共沉淀（Co-im

6、munoprecipitation， Co-Ip）檢測(cè)NR2B和PSD-95的相互作用。
　　2.腰段鞘內(nèi)置管成功的雄性Wistar成年大鼠隨機(jī)分為3組:CCI+二甲基亞砜組（CCI+DMSO組）、CCI+Ro25-698130 nmol/10μl組和CCI+Ro100 nmol/10μl組。Ro25-6981為NR2B的選擇性拮抗劑。CCI術(shù)后第7天開(kāi)始鞘內(nèi)注射DMSO或Ro25-6981（溶于100％DMSO），觀察NR2B拮

7、抗劑對(duì)大鼠機(jī)械痛閾和熱痛閾的影響。
　　3.腰段鞘內(nèi)置管成功的雄性Wistar成年大鼠隨機(jī)分為4組:Sham組、CCI組、CCI+DMSO組、CCI+Ro25-6981100 nmol/10μl組。CCI術(shù)后第7天開(kāi)始鞘內(nèi)注射DMSO或Ro25-6981（溶于100％DMSO），取腰膨大段脊髓背角用Westernblot和Co-Ip檢測(cè)TRPV1的表達(dá)以及NR2B和PSD-95的相互作用。
　　4.腰段鞘內(nèi)置管成功的雄性Wi

8、star成年大鼠隨機(jī)分為8組:空白對(duì)照組（Navie組）、載體對(duì)照(PEI)組、RNA干擾（TRPV1-RNAi）后1天組（1d組）、TRPV1-RNAi3天組（3d組）、5天組（5d組）、7天組（7d組）、14天組(14d組)、21天組（21d組）。CCI術(shù)后第7天開(kāi)始鞘內(nèi)注射PEI或TRPV1-siRNA（溶于PEI），觀察TRPV1-siRNA對(duì)脊髓背角TRPV1的沉默效率。
　　5.腰段鞘內(nèi)置管成功的雄性Wistar成年大

9、鼠隨機(jī)分為3組:CCI組、CCI+PEI組、CCI+TRPV1-siRNA5μg/15μl組。CCI術(shù)后第7天開(kāi)始鞘內(nèi)注射PEI或TRPV1-siRNA（溶于PEI），觀察TRPV1 RNA干擾對(duì)大鼠機(jī)械痛閾和熱痛閾的影響。
　　究結(jié)果：
　　1.術(shù)前兩組大鼠機(jī)械痛閾和熱痛閾無(wú)顯著性差異（P＞0.05），術(shù)后第1天，CCI組機(jī)械痛閾和熱痛閾較Sham組明顯下降（P＜0.05），持續(xù)至28天以上(P＜0.05)。脊髓腰膨大處T

10、RPV1表達(dá)水平測(cè)定顯示，術(shù)后7天CCI組TRPV1的表達(dá)較Sham組顯著性增加（P＜0.05），NR2B的表達(dá)未見(jiàn)顯著性變化（P＞0.05）;免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)，CCI大鼠脊髓背角NR2B和PSD-95的相互作用顯著性增加（P＜0.05)。
　　2.NR2B拮抗劑給藥前各組大鼠機(jī)械痛閾和熱痛閾無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。在CCI術(shù)后第7天開(kāi)始鞘內(nèi)注射DMSO或Ro25-6981（溶于100％DMSO）。結(jié)果顯示，與溶媒組比較，Ro

11、25-6981100 nmol/d組能顯著性提高大鼠熱痛閾(P＜0.05)，但機(jī)械痛閾的變化沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　3.大鼠CCI后7天，鞘內(nèi)給予NR2B拮抗劑Ro25-6981100 nmol/d連續(xù)3d。Western blot結(jié)果顯示，鞘內(nèi)給予Ro25-6981的大鼠，脊髓背角TRPV1蛋白質(zhì)的表達(dá)降低，與DMSO組比較，差異有顯著性(P＜0.05)。Co-Ip結(jié)果顯示，鞘內(nèi)給予Ro25-6981的大鼠，脊髓背

12、角NR2B和PSD-95的相互作用降低，與DMSO組比較，差異有顯著性(P＜0.05)。
　　4.應(yīng)用在體RNA干擾技術(shù)，對(duì)脊髓背角TRPV1進(jìn)行了基因沉默。Western blot結(jié)果顯示，在鞘內(nèi)轉(zhuǎn)染TRPV1-siRNA5μg/d，連續(xù)2天，其基因沉默的效率達(dá)到50％，作用高峰產(chǎn)生在轉(zhuǎn)染后1天，隨后，TRPV1的表達(dá)逐漸恢復(fù)，至第5天達(dá)到對(duì)照水平。
　　5.打藥前三組大鼠機(jī)械痛閾和熱痛閾無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。 C

13、CI后7天，鞘內(nèi)給予TRPV1-siRNA5μg/d，連續(xù)2天，觀察了大鼠疼痛閾值的變化。結(jié)果顯示，大鼠機(jī)械縮足反射閾值和熱縮足反射潛伏期提高。與對(duì)照組比較，差異有顯著性(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.脊髓背角TRPV1的上調(diào)介導(dǎo)了大鼠CCI引起的神經(jīng)病理性疼痛。
　　2.脊髓背角NR2B通過(guò)與PSD-95的相互作用介導(dǎo)了大鼠CCI引起的熱痛覺(jué)過(guò)敏，但不介導(dǎo)機(jī)械痛覺(jué)過(guò)敏。
　　3.脊髓背角TRPV1的上調(diào)