Najanalgesin抗大鼠神經病理性疼痛的鎮(zhèn)痛作用及機制.pdf

1、神經病理性疼痛(neuropathic pain)是中樞或外周神經系統(tǒng)損傷或病變引起的疼痛綜合征，以自發(fā)性疼痛、痛過敏和痛超敏為特征，嚴重影響人類的生活質量。目前臨床上使用的鎮(zhèn)痛藥物并不能獲得十分滿意的治療效果。1933年，Monadesser最早將蛇毒用于臨床治療，用提取的眼鏡蛇毒治療癌痛病人獲得顯著的鎮(zhèn)痛效果。后來美國的Hynson,Westco&Duning公司將蛇毒制成兩種鎮(zhèn)痛藥Cobroxin和Nyloxin，前者用于治療頑固

2、性疼痛及惡性腫瘤痛，后者用于治療關節(jié)痛，已列入美國藥物局方中。因此，蛇毒作為鎮(zhèn)痛藥物引起了研究者的注意。二十世紀早期蛇毒鎮(zhèn)痛的研究多是作用于急性生理性疼痛模型。隨著疼痛機制的深入研究，人們發(fā)現(xiàn)急性生理性疼痛和慢性病理性疼痛的發(fā)生機制有著明顯的差別。因此，蛇毒對病理性疼痛是否具有鎮(zhèn)痛作用及其機制如何尚不清楚。最近研究報道免疫調節(jié)與炎性反應在病理性疼痛的發(fā)生和發(fā)展過程中具有重要的作用，免疫樣膠質細胞以及促炎性細胞因子成為病理性疼痛研究的重點

3、。那么蛇毒對病理性疼痛的鎮(zhèn)痛作用是否與其免疫調節(jié)和抗炎作用有關有待于進一步研究。因此，本課題擬從中華眼鏡蛇毒中分離純化得到具有鎮(zhèn)痛活性的單一成分，采用L5脊神經結扎并剪斷的大鼠神經病理性疼痛模型，觀察分離得到的單一成分是否具有抗大鼠神經病理性疼痛的作用，以及探討其作用機制是否與脊髓膠質細胞有關，為神經病理性疼痛開辟新的有效治療途徑和研制開發(fā)新的藥物提供一定的實驗基礎和理論依據(jù)。
　　 方法及結果：
　　 ⑴運用親和層析、

4、凝膠過濾層析兩步柱層析法從中華眼鏡蛇粗毒中分離得到具有鎮(zhèn)痛活性的蛋白成分，根據(jù)來源，命名為眼鏡蛇鎮(zhèn)痛素(najanalgesin)。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，高效液相(HPLC)，質譜和氨基酸測序的方法，檢測najanalgesin的純度，相對分子質量和N端氨基酸組成。結果表明najanalgesin純度為96.88％，相對分子量質為6.7 kD。應用生物信息學工具對najanalgesin的氨基酸序列進行檢索分析后發(fā)

5、現(xiàn)其與眼鏡蛇蛇毒中的心臟毒素具有很高的相似性。通過蛙心實驗證實眼鏡蛇鎮(zhèn)痛素(najanalgesin)為一種心臟毒素。
　　 ⑵觀察najanalgesin對L5脊神經結扎并剪斷引起的神經病理性疼痛大鼠是否具有鎮(zhèn)痛作用及其影響因素。結果顯示腹腔注射najanalgesin可顯著抑制神經病理性疼痛大鼠的機械性痛敏和熱痛敏，而且發(fā)現(xiàn)單次腹腔注射najanalgesin對神經病理性疼痛大鼠的鎮(zhèn)痛作用持續(xù)時間可長達1周。鞘內給予naja

6、nalgesin同樣對神經病理性疼痛大鼠的機械性痛敏產生明顯的抑制作用。預先給予阿片肽受體拮抗劑納絡酮和膽堿能受體拮抗劑阿托品能部分阻斷najanalgesin的鎮(zhèn)痛作用。以上結果提示najanalgesin對神經病理性疼痛大鼠具有中樞和外周鎮(zhèn)痛作用，其鎮(zhèn)痛作用與內源性阿片肽系統(tǒng)和中樞膽堿能系統(tǒng)有關。
　　 ⑶探討najanalgesin對L5脊神經結扎并剪斷引起的神經病理性疼痛大鼠的鎮(zhèn)痛作用是否與脊髓背角的膠質細胞以及JNK信

7、號蛋白有關。我們觀察到神經病理性疼痛大鼠模型建立后出現(xiàn)明顯的機械性痛敏，而鞘內給予najanalgesin后對大鼠機械性刺激的痛閾顯著提高。如果預先鞘內給予膠質細胞的阻斷劑氟代檸檬酸能顯著增強najanalgesin的鎮(zhèn)痛作用，而提前鞘內給予小膠質細胞的阻斷劑米諾環(huán)素并不影響najanalgesin的鎮(zhèn)痛作用，結果提示najanalgesin對神經病理性疼痛大鼠的鎮(zhèn)痛作用可能與脊髓星型膠質細胞有關。進一步通過免疫組織化學染色和免疫印跡實

8、驗技術觀察神經病理性疼痛大鼠以及鞘內給予najanalgesin后，脊髓背角星型膠質細胞的標記物(glial fibrilary acidic protein，GFAP)的分布和激活的情況。實驗結果發(fā)現(xiàn)神經病理性疼痛大鼠模型建立后，脊髓背角的星型膠質細胞GFAP表達明顯增加，而給予najanalgesi后，脊髓背角的星型膠質GFAP激活明顯降低。同樣發(fā)現(xiàn)L5脊神經損傷后脊髓背角星型膠質細胞內p-JNK蛋白以及其下游p-c-Jun蛋白表達

9、顯著增加，但鞘內注射najanalgesin可以顯著抑制星型膠質細胞內的p-JNK以及c-Jun蛋白的上調反應。結果提示najanalgesin對神經病理性疼痛大鼠的鎮(zhèn)痛作用與脊髓星型膠質細胞和胞內JNK信號分子及其下游c-Jun蛋白有關。
　　 結論：
　　 ①通過兩步柱層析法獲得的najanalgesin純度為96.88％(HPLC)，相對分子質量為6.74 kDa，同源性檢索和蛙心實驗證實najanalgesin是

10、一種心臟毒素。
　　 ②成功復制了L5脊神經結扎并剪斷的大鼠病理性疼痛模型，產生明顯的、穩(wěn)定誘發(fā)性機械性痛敏和熱痛敏，存在“鏡像痛”。
　　 ③Najanalgesin對病理性疼痛大鼠具有外周鎮(zhèn)痛作用，鎮(zhèn)痛作用強，持續(xù)時間長。
　　 ④Najanalgesin對病理性疼痛大鼠具有中樞鎮(zhèn)痛作用，并與中樞膽堿能和阿片肽系統(tǒng)有關。
　　 ⑤Najanalgsin通過抑制脊髓星型膠質細胞的激活和JNK蛋白表達的升