Najanalgesin抗大鼠神經(jīng)病理性疼痛的鎮(zhèn)痛作用及機(jī)制.pdf

1、神經(jīng)病理性疼痛(neuropathic pain)是中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)損傷或病變引起的疼痛綜合征，以自發(fā)性疼痛、痛過敏和痛超敏為特征，嚴(yán)重影響人類的生活質(zhì)量。目前臨床上使用的鎮(zhèn)痛藥物并不能獲得十分滿意的治療效果。1933年，Monadesser最早將蛇毒用于臨床治療，用提取的眼鏡蛇毒治療癌痛病人獲得顯著的鎮(zhèn)痛效果。后來美國的Hynson,Westco&Duning公司將蛇毒制成兩種鎮(zhèn)痛藥Cobroxin和Nyloxin，前者用于治療頑固

2、性疼痛及惡性腫瘤痛，后者用于治療關(guān)節(jié)痛，已列入美國藥物局方中。因此，蛇毒作為鎮(zhèn)痛藥物引起了研究者的注意。二十世紀(jì)早期蛇毒鎮(zhèn)痛的研究多是作用于急性生理性疼痛模型。隨著疼痛機(jī)制的深入研究，人們發(fā)現(xiàn)急性生理性疼痛和慢性病理性疼痛的發(fā)生機(jī)制有著明顯的差別。因此，蛇毒對病理性疼痛是否具有鎮(zhèn)痛作用及其機(jī)制如何尚不清楚。最近研究報(bào)道免疫調(diào)節(jié)與炎性反應(yīng)在病理性疼痛的發(fā)生和發(fā)展過程中具有重要的作用，免疫樣膠質(zhì)細(xì)胞以及促炎性細(xì)胞因子成為病理性疼痛研究的重點(diǎn)

3、。那么蛇毒對病理性疼痛的鎮(zhèn)痛作用是否與其免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用有關(guān)有待于進(jìn)一步研究。因此，本課題擬從中華眼鏡蛇毒中分離純化得到具有鎮(zhèn)痛活性的單一成分，采用L5脊神經(jīng)結(jié)扎并剪斷的大鼠神經(jīng)病理性疼痛模型，觀察分離得到的單一成分是否具有抗大鼠神經(jīng)病理性疼痛的作用，以及探討其作用機(jī)制是否與脊髓膠質(zhì)細(xì)胞有關(guān)，為神經(jīng)病理性疼痛開辟新的有效治療途徑和研制開發(fā)新的藥物提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
　　 方法及結(jié)果：
　　 ⑴運(yùn)用親和層析、

4、凝膠過濾層析兩步柱層析法從中華眼鏡蛇粗毒中分離得到具有鎮(zhèn)痛活性的蛋白成分，根據(jù)來源，命名為眼鏡蛇鎮(zhèn)痛素(najanalgesin)。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，高效液相(HPLC)，質(zhì)譜和氨基酸測序的方法，檢測najanalgesin的純度，相對分子質(zhì)量和N端氨基酸組成。結(jié)果表明najanalgesin純度為96.88％，相對分子量質(zhì)為6.7 kD。應(yīng)用生物信息學(xué)工具對najanalgesin的氨基酸序列進(jìn)行檢索分析后發(fā)

5、現(xiàn)其與眼鏡蛇蛇毒中的心臟毒素具有很高的相似性。通過蛙心實(shí)驗(yàn)證實(shí)眼鏡蛇鎮(zhèn)痛素(najanalgesin)為一種心臟毒素。
　　 ⑵觀察najanalgesin對L5脊神經(jīng)結(jié)扎并剪斷引起的神經(jīng)病理性疼痛大鼠是否具有鎮(zhèn)痛作用及其影響因素。結(jié)果顯示腹腔注射najanalgesin可顯著抑制神經(jīng)病理性疼痛大鼠的機(jī)械性痛敏和熱痛敏，而且發(fā)現(xiàn)單次腹腔注射najanalgesin對神經(jīng)病理性疼痛大鼠的鎮(zhèn)痛作用持續(xù)時(shí)間可長達(dá)1周。鞘內(nèi)給予naja

6、nalgesin同樣對神經(jīng)病理性疼痛大鼠的機(jī)械性痛敏產(chǎn)生明顯的抑制作用。預(yù)先給予阿片肽受體拮抗劑納絡(luò)酮和膽堿能受體拮抗劑阿托品能部分阻斷najanalgesin的鎮(zhèn)痛作用。以上結(jié)果提示najanalgesin對神經(jīng)病理性疼痛大鼠具有中樞和外周鎮(zhèn)痛作用，其鎮(zhèn)痛作用與內(nèi)源性阿片肽系統(tǒng)和中樞膽堿能系統(tǒng)有關(guān)。
　　 ⑶探討najanalgesin對L5脊神經(jīng)結(jié)扎并剪斷引起的神經(jīng)病理性疼痛大鼠的鎮(zhèn)痛作用是否與脊髓背角的膠質(zhì)細(xì)胞以及JNK信

7、號蛋白有關(guān)。我們觀察到神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型建立后出現(xiàn)明顯的機(jī)械性痛敏，而鞘內(nèi)給予najanalgesin后對大鼠機(jī)械性刺激的痛閾顯著提高。如果預(yù)先鞘內(nèi)給予膠質(zhì)細(xì)胞的阻斷劑氟代檸檬酸能顯著增強(qiáng)najanalgesin的鎮(zhèn)痛作用，而提前鞘內(nèi)給予小膠質(zhì)細(xì)胞的阻斷劑米諾環(huán)素并不影響najanalgesin的鎮(zhèn)痛作用，結(jié)果提示najanalgesin對神經(jīng)病理性疼痛大鼠的鎮(zhèn)痛作用可能與脊髓星型膠質(zhì)細(xì)胞有關(guān)。進(jìn)一步通過免疫組織化學(xué)染色和免疫印跡實(shí)

8、驗(yàn)技術(shù)觀察神經(jīng)病理性疼痛大鼠以及鞘內(nèi)給予najanalgesin后，脊髓背角星型膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記物(glial fibrilary acidic protein，GFAP)的分布和激活的情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型建立后，脊髓背角的星型膠質(zhì)細(xì)胞GFAP表達(dá)明顯增加，而給予najanalgesi后，脊髓背角的星型膠質(zhì)GFAP激活明顯降低。同樣發(fā)現(xiàn)L5脊神經(jīng)損傷后脊髓背角星型膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)p-JNK蛋白以及其下游p-c-Jun蛋白表達(dá)

9、顯著增加，但鞘內(nèi)注射najanalgesin可以顯著抑制星型膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的p-JNK以及c-Jun蛋白的上調(diào)反應(yīng)。結(jié)果提示najanalgesin對神經(jīng)病理性疼痛大鼠的鎮(zhèn)痛作用與脊髓星型膠質(zhì)細(xì)胞和胞內(nèi)JNK信號分子及其下游c-Jun蛋白有關(guān)。
　　 結(jié)論：
　　 ①通過兩步柱層析法獲得的najanalgesin純度為96.88％(HPLC)，相對分子質(zhì)量為6.74 kDa，同源性檢索和蛙心實(shí)驗(yàn)證實(shí)najanalgesin是

10、一種心臟毒素。
　　 ②成功復(fù)制了L5脊神經(jīng)結(jié)扎并剪斷的大鼠病理性疼痛模型，產(chǎn)生明顯的、穩(wěn)定誘發(fā)性機(jī)械性痛敏和熱痛敏，存在“鏡像痛”。
　　 ③Najanalgesin對病理性疼痛大鼠具有外周鎮(zhèn)痛作用，鎮(zhèn)痛作用強(qiáng)，持續(xù)時(shí)間長。
　　 ④Najanalgesin對病理性疼痛大鼠具有中樞鎮(zhèn)痛作用，并與中樞膽堿能和阿片肽系統(tǒng)有關(guān)。
　　 ⑤Najanalgsin通過抑制脊髓星型膠質(zhì)細(xì)胞的激活和JNK蛋白表達(dá)的升