脊髓背角自噬對(duì)大鼠神經(jīng)病理性疼痛的影響及機(jī)制研究.pdf

1、本文分三個(gè)部分進(jìn)行探討：
　　第一部分：脊神經(jīng)結(jié)扎神經(jīng)病理性疼痛模型大鼠脊髓背角自噬的變化
　　目的：建立大鼠脊神經(jīng)結(jié)扎神經(jīng)病理性疼痛模型，并觀察大鼠脊髓背角自噬的變化。
　　方法：雄性SD大鼠（200 g~220 g）60只，隨機(jī)分為兩組(n=30)：假手術(shù)組(sham組)和脊神經(jīng)結(jié)扎組(SNL組)。SNL組大鼠行左側(cè)腰5脊神經(jīng)結(jié)扎術(shù)，sham組大鼠僅暴露并分離左側(cè)腰5脊神經(jīng)。測(cè)定各組大鼠術(shù)前1 d（基礎(chǔ)值）和術(shù)后1

2、，3，5，7 d機(jī)械痛閾（PWT）和熱痛閾（PWL）。每組大鼠于術(shù)后1，3，5，7 d隨機(jī)取6只處死，Western blot法檢測(cè)大鼠左側(cè)腰5脊髓背角微管相關(guān)輕鏈蛋白3（LC3）和泛素結(jié)合蛋白p62的表達(dá)。SNL組大鼠在術(shù)后第7 d隨機(jī)取4只處死，取左側(cè)腰5脊髓背角行p62/NeuN、p62/GFAP、p62/CD11b雙重免疫熒光標(biāo)記染色。
　　結(jié)果：和sham組相比，SNL組大鼠PWT和PWL分別在術(shù)后第1天和第3天明顯降低

3、，并持續(xù)到第7天(P<0.05)，脊髓LC3-Ⅱ、p62表達(dá)明顯增高(P<0.05)。雙重免疫熒光標(biāo)記染色結(jié)果顯示p62與NeuN、CD11b共表達(dá)。
　　結(jié)論：成功建立了大鼠脊神經(jīng)結(jié)扎神經(jīng)病理性疼痛模型，脊髓背角神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞自噬受損可能參與了脊神經(jīng)結(jié)扎引起的大鼠神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生和發(fā)展。
　　第二部分：調(diào)節(jié)自噬對(duì)神經(jīng)病理性疼痛大鼠痛閾及脊髓背角白介素-1β的影響
　　目的：研究上調(diào)或抑制自噬對(duì)神經(jīng)病理性疼痛大

4、鼠痛閾及脊髓背角白介素-1β的影響。
　　方法：雄性SD大鼠（200 g~220 g）60只，隨機(jī)分為4組(n=15)：假手術(shù)組(sham組)，脊神經(jīng)結(jié)扎組(SNL組)，雷帕霉素處理組（Rap組）和3-甲基腺嘌呤（3-MA）處理組（3-MA組）。各組大鼠經(jīng)L4-5鞘內(nèi)置管后，SNL組、Rap和3-MA組大鼠行左側(cè)腰5脊神經(jīng)結(jié)扎術(shù)，sham組大鼠分離左側(cè)腰5脊神經(jīng)但不結(jié)扎。Rap組和3-MA組大鼠于SNL術(shù)后30 min分別經(jīng)鞘內(nèi)置

5、管給予雷帕霉素0.1μg和3-MA30μg；sham組和SNL組大鼠則給與等容溶劑（5％DMSO10μl）。每日一次，連續(xù)7天。測(cè)定各組大鼠術(shù)前1 d（基礎(chǔ)值）和術(shù)后1，3，5，7 d機(jī)械痛閾（PWT）和熱痛閾（PWL）。7 d后處死大鼠，各組取6只Western blot檢測(cè)大鼠左側(cè)腰5脊髓背角微管相關(guān)輕鏈蛋白3（LC3）和泛素結(jié)合蛋白p62的表達(dá)；取3只大鼠在透射電鏡下觀察左側(cè)脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞自噬體；取6只大鼠ELISA法檢測(cè)大鼠

6、左側(cè)腰5脊髓背角白介素-1β（IL-1β）水平。
　　結(jié)果：和sham組相比，SNL組大鼠PWT和PWL明顯降低(P<0.05)，脊髓LC3-Ⅱ、p62及IL-1β表達(dá)明顯增高(P<0.05)。和SNL組相比，Rap組大鼠PWT、PWL、脊髓LC3-Ⅱ和小膠質(zhì)細(xì)胞自噬體明顯升高(P<0.05)，p62和IL-1β表達(dá)明顯降低(P<0.05)；而3-MA組大鼠PWT、PWL、脊髓LC3-Ⅱ和小膠質(zhì)細(xì)胞自噬體明顯降低(P<0.05)，

7、p62和IL-1β表達(dá)明顯增高(P<0.05)。
　　結(jié)論：上調(diào)自噬能減輕神經(jīng)病理性疼痛，而抑制自噬加重神經(jīng)病理性疼痛；其機(jī)制與脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞自噬對(duì)脊髓背角IL-1β水平的影響有關(guān)。
　　第三部分：調(diào)節(jié)自噬對(duì)神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓背角神經(jīng)元凋亡的影響
　　目的：研究調(diào)節(jié)自噬對(duì)神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓背角神經(jīng)元凋亡的影響
　　方法：實(shí)驗(yàn)1.30只SD大鼠鞘內(nèi)置管后隨機(jī)分為3組(n=10)：假手術(shù)組(sham組)，

8、脊神經(jīng)結(jié)扎組(SNL組)，雷帕霉素處理組（Rap組）。Sham組大鼠分離左側(cè)腰5脊神經(jīng)但不結(jié)扎，Rap組大鼠于SNL術(shù)后30 min經(jīng)鞘內(nèi)置管給予雷帕霉素0.1μg， Sham組和SNL組大鼠則給予等容溶劑（5％DMSO10μl）。藥物每日鞘內(nèi)注射一次，連續(xù)7天。
　　實(shí)驗(yàn)2.30只SD大鼠鞘內(nèi)置管后隨機(jī)分為3組(n=10)：假手術(shù)組(sham組)，脊神經(jīng)結(jié)扎組(SNL組)，3-甲基腺嘌呤（3-MA）處理組（3-MA組）。Sham

9、組大鼠分離左側(cè)腰5脊神經(jīng)但不結(jié)扎，3-MA組大鼠于SNL術(shù)后30 min經(jīng)鞘內(nèi)置管給予3-MA30μg。Sham組和3-MA組大鼠則給予等容溶劑（5％DMSO10μl）。藥物每日鞘內(nèi)注射一次，連續(xù)3天。
　　實(shí)驗(yàn)1和實(shí)驗(yàn)2分別于SNL術(shù)后7 d和3 d處死大鼠并取左側(cè)腰5脊髓背角。各組取3只透射電鏡下觀察神經(jīng)元，剩余7只大鼠用Western blot法檢測(cè)脊髓背角活化的caspase3和NeuN表達(dá)。
　　結(jié)果：實(shí)驗(yàn)1：和s

10、ham組相比，電鏡下SNL組大鼠脊髓背角神經(jīng)元受損明顯，caspase3明顯增高(P<0.05)，NeuN明顯降低(P<0.05)；和SNL相比，電鏡下Rap組脊髓背角神經(jīng)元受損較輕，自噬體增多，caspase3明顯降低(P<0.05)，NeuN明顯增高(P<0.05)。
　　實(shí)驗(yàn)2：和sham組相比，電鏡下SNL組大鼠脊髓背角神經(jīng)元受損明顯，caspase3明顯增高(P<0.05)，而NeuN未見(jiàn)明顯變化；和SNL相比，電鏡下3