脊髓脂氧素在大鼠神經(jīng)病理性疼痛及電針鎮(zhèn)痛中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、神經(jīng)病理性疼痛(Neuropathic Pain，NP，簡稱神經(jīng)痛)是由軀體感覺神經(jīng)系統(tǒng)的損傷或相關(guān)疾病而造成的疼痛。神經(jīng)痛是作為一類常見的慢性疼痛，與許多影響周圍和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的疾病有關(guān)，如三叉神經(jīng)痛、帶狀皰疹后神經(jīng)痛(PHN)、糖尿病痛性神經(jīng)病(DPN)、腦卒中后、帕金森病(PD)及多發(fā)性硬化(MS)等疾病。按國際上神經(jīng)痛普通人群中的發(fā)病率約為8％推算，中國約有0.9億神經(jīng)痛患者。神經(jīng)痛日益影響患者情緒及生活質(zhì)量，嚴(yán)重則可致殘疾，已

2、成為公眾關(guān)注的重要健康疾病。因此，深入探討神經(jīng)痛的發(fā)病與治療機(jī)制，在臨床與基礎(chǔ)中均具有十分重要的意義。
　　近年來的研究證實(shí)，脂氧素(Lipoxins，LXs)作為機(jī)體一類內(nèi)源性的抗炎脂類介質(zhì)，是來源于花生四烯酸、經(jīng)脂氧合酶(Lipoxygenase，LO)催化合成的一類生物活性物質(zhì)。在哺乳動物中，LXs主要包括脂氧素A4(LXA4)和脂氧素B4(LXB4)，因其在抗炎和促炎癥消退中發(fā)揮重要的作用，而喻為炎癥的“剎車信號”。

3、>　　針灸作為祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中一重要的治療方法，在臨床中常用于治療各種神經(jīng)痛，在基礎(chǔ)研究中其抗炎鎮(zhèn)痛作用亦比較明確。以往研究表明，AA相關(guān)代謝物和酶（前列腺素、COX-2、白細(xì)胞三烯等）在疼痛及電針抗炎鎮(zhèn)痛中發(fā)揮重要作用，此外合成LXA4中的重要酶5-LO亦介導(dǎo)神經(jīng)痛的發(fā)展。
　　綜上所述，本論文擬在神經(jīng)痛模型上，采用行為學(xué)、分子生物學(xué)等技術(shù)開展以下研究:(1)觀察神經(jīng)痛動物模型第7天，ATL對神經(jīng)痛大鼠機(jī)械痛行為學(xué)和脊髓炎癥因子的

4、影響;(2)觀察脊髓JAK2-pSTAT3在神經(jīng)痛及ATL抗炎鎮(zhèn)痛中的作用;(3)觀察電針對神經(jīng)痛行為學(xué)的影響，分析電針抗炎鎮(zhèn)痛的分子機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　第一部分 脂氧素類似物ATL對神經(jīng)痛大鼠機(jī)械痛及脊髓炎性細(xì)胞因子表達(dá)變化的影響
　　1.神經(jīng)痛大鼠的機(jī)械性痛覺超敏及熱痛覺過敏行為學(xué)變化
　　將大鼠隨機(jī)分為3組，正常組(Normal)、假手術(shù)組（Sham）和模型組(Model)，每組8只。模型大鼠右

5、側(cè)大腿暴露坐骨神經(jīng)，4-0鉻制羊腸線結(jié)扎坐骨神經(jīng)，假手術(shù)組只暴露坐骨神經(jīng)而不結(jié)扎。從術(shù)后第2天開始，測量大鼠患側(cè)后肢的機(jī)械性痛閾值(Paw Withdrawal Threshold，PWT)和熱痛閾值(Paw WithdrawalLatency，PWL)，持續(xù)至造模后第21天。
　　2.神經(jīng)痛大鼠脊髓脂氧素受體ALX細(xì)胞定位及表達(dá)變化
　　采用免疫熒光雙標(biāo)結(jié)合激光共聚焦方法，研究結(jié)果表明，與正常組、假手術(shù)組相比，模型組脊髓A

6、LX免疫陽性細(xì)胞數(shù)量無顯著差異;脊髓ALX免疫陽性物質(zhì)大部分和星形膠質(zhì)細(xì)胞共標(biāo)，小部分與神經(jīng)元共標(biāo)，而與小膠質(zhì)細(xì)胞不共標(biāo)。
　　3.不同劑量ATL對神經(jīng)痛大鼠機(jī)械痛行為變化的影響
　　大鼠隨機(jī)分為CCI+ATL組、CCI+NS組、CCI+BOC-2組、CCI+BOC-2+ATL組、Sham+ATL組，Sham組，每組6只。在神經(jīng)痛大鼠術(shù)后7天，單次鞘內(nèi)給予不同劑量ATL50ng、100ng、200ng，觀察ATL在神經(jīng)痛大鼠

7、的中樞鎮(zhèn)痛作用;尾靜脈單次給藥ATL10ug/kg、40ug/kg，觀察ATL的全身鎮(zhèn)痛作用。
　　結(jié)論:模型大鼠出現(xiàn)患側(cè)后肢機(jī)械痛閾和熱痛閾降低的現(xiàn)象，證實(shí)神經(jīng)痛大鼠模型制備成功。ATL通過與脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞表面受體ALX結(jié)合，降低模型大鼠的脊髓神經(jīng)炎癥反應(yīng)，提高機(jī)械痛閾。ATL可通過全身作用途徑，減輕機(jī)械性痛覺超敏。
　　第二部分 JAK2-STAT3在神經(jīng)痛及ATL抗炎鎮(zhèn)痛的作用
　　1.ATL對神經(jīng)痛大鼠脊

8、髓p-STAT3及SOCS1-3表達(dá)變化的影響
　　將大鼠隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、模型組、CCI+DMSO組，CCI+ATL組，術(shù)后第7天取材行Western-Blot、Real-Time PCR和免疫熒光結(jié)合激光共聚焦實(shí)驗(yàn)方法。結(jié)果顯示，與正常組和假手術(shù)組相比，神經(jīng)痛模型大鼠脊髓p-STAT3表達(dá)顯著上調(diào)，SOCS2 mRNA、SOCS3 mRNA表達(dá)顯著升高。與CCI+DMSO組相比，鞘內(nèi)給予ATL200ng1h后可進(jìn)一步顯

9、著上調(diào)SOCS3 mRNA的表達(dá)，對SOCS1 mRNA、SOCS2 mRNA的表達(dá)無顯著影響;ATL在給藥4h后顯著下調(diào)脊髓p-STAT3的表達(dá)。
　　2.JAK2-STAT3信號通路在大鼠神經(jīng)痛中的作用
　　2.1JAK2抑制劑AG490對神經(jīng)痛大鼠機(jī)械痛行為變化的影響
　　大鼠隨機(jī)分為正常組，CCI+DMSO組，CCI+AG490-1ug組，CCI+AG490-5ug組，每組10只。AG490組在造模前2小時及造

10、模后第1天，第2天分別給予鞘內(nèi)注射1ug，5ug AG490，共鞘內(nèi)注射3次，并于造模后第2天，第4天，第7天觀察機(jī)械痛行為的變化。
　　2.2AG490對神經(jīng)痛大鼠脊髓炎性細(xì)胞因子表達(dá)變化的影響
　　實(shí)驗(yàn)大鼠分為正常組，CCI+DMSO組，CCI+AG490-5ug組，AG490組在造模前2小時及造模后第1天，第2天給予鞘內(nèi)注射5ug AG490，共鞘內(nèi)注射3次，并于造模后第7天新鮮取材檢測脊髓炎性細(xì)胞因子的表達(dá)變化。Re

11、al-Time PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與CCI+DMSO組比較，鞘內(nèi)注射AG490-5ug可顯著降低脊髓IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA的水平。
　　結(jié)論:脊髓JAK2-STAT3-SOCS信號通路參與神經(jīng)痛的發(fā)生發(fā)展，ATL可通過調(diào)節(jié)脊髓p-STAT3表達(dá)變化而發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛作用。
　　第三部分 電針對神經(jīng)痛大鼠抗炎鎮(zhèn)痛的脊髓分子機(jī)制
　　1.電針對不同時程神經(jīng)痛大鼠的行為學(xué)及分子機(jī)制
　　1.1電針對不

12、同時程神經(jīng)痛大鼠的機(jī)械痛及熱痛行為學(xué)的影響
　　大鼠隨機(jī)分為CCI組，CCI+EA組和CCI+SEA組，每組6只。采用Von-Freyhairs（弗萊毛測痛法）和熱輻射測痛儀，檢測神經(jīng)痛大鼠患側(cè)（右側(cè)）足底機(jī)械痛閾(PWT)和熱痛閾(PWL)變化。將實(shí)驗(yàn)大鼠按神經(jīng)痛不同時程（術(shù)后3、7、21日，即POD3、POD7、POD21）分為3批進(jìn)行電針干預(yù)實(shí)驗(yàn)。
　　研究結(jié)果提示，單次電針30min對不同時程(POD3、POD7、P

13、OD21)神經(jīng)痛大鼠的痛行為（熱痛、機(jī)械痛）均有明顯改善作用，可在電針后30min、45min、60 min、90min不同時間點(diǎn)發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用，其中在改善機(jī)械痛、熱痛行為學(xué)方面，以電針后60min較為顯著。
　　1.2電針對不同時程神經(jīng)痛大鼠脊髓5-LO及Annexin A1的影響
　　采用Real-Time PCR方法，檢測單次電針對不同時程神經(jīng)痛大鼠脊髓5-LOmRNA和AnnexinA1 mRNA水平變化的影響。研究結(jié)

14、果顯示，在術(shù)后第3天，單次電針可提高神經(jīng)痛大鼠的脊髓5-LOmRNA水平（**P＜0.01），而對AnnexinA1mRNA變化不影響;在術(shù)后第7天，單次電針可提高AnnexinA1 mRNA水平，而對5-LO mRNA不影響;在術(shù)后第21天，單次電針均可提高AnnexinA1 mRNA和5-LO mRNA水平。
　　2.神經(jīng)痛大鼠脊髓脂氧素受體ALX在電針鎮(zhèn)痛中的作用
　　2.1ALX拮抗劑BOC-2對電針鎮(zhèn)痛時機(jī)械痛行為

15、變化的影響
　　將大鼠隨機(jī)分為CCI組、CCI+Sham-EA組，CCI+EA組，CCI+EA+BOC-2組，觀察電針及鞘內(nèi)注射BOC-2對神經(jīng)痛大鼠機(jī)械痛行為的影響。與假電針組相比，神經(jīng)痛大鼠經(jīng)單次電針或多次電針干預(yù)后，均可顯著提高機(jī)械痛閾，而電針的即刻和累積鎮(zhèn)痛效應(yīng)均可被單次或多次鞘內(nèi)注射的BOC-2逆轉(zhuǎn)，而神經(jīng)痛大鼠單純鞘內(nèi)注射BOC-2并未影響機(jī)械痛閾。
　　2.2BOC-2對電針鎮(zhèn)痛時脊髓炎性細(xì)胞因子表達(dá)變化的影響

16、
　　將大鼠隨機(jī)分為CCI組、CCI+MEA組和CCI+MEA+BOC-2組，觀察多次電針及鞘內(nèi)注射BOC-2對神經(jīng)痛大鼠脊髓炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響。與模型組相比，多次電針可顯著降低神經(jīng)痛大鼠脊髓IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA的水平，而脊髓鞘內(nèi)注射BOC-2可逆轉(zhuǎn)多次電針的抗神經(jīng)炎癥效果。
　　結(jié)論:電針可能通過上調(diào)5-LO mRNA和AnnexinA1 mRNA表達(dá)，增加神經(jīng)痛大鼠體內(nèi)ALX配體物質(zhì)的生成，部分

17、通過ALX信號通路，下調(diào)脊髓炎性細(xì)胞因子表達(dá)，提高神經(jīng)痛大鼠的機(jī)械痛閾。
　　綜上所述，本工作提示:
　　1.脂氧素受體ALX主要表達(dá)于脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞。脂氧素類似物ATL與細(xì)胞表面受體ALX特異性結(jié)合，抑制脊髓的神經(jīng)炎癥過程，減輕神經(jīng)痛大鼠的機(jī)械痛覺超敏。ATL在靜脈給藥后也發(fā)揮全身抗炎鎮(zhèn)痛的作用。
　　2.在神經(jīng)痛過程中，脊髓p-STAT3，SOCS2 mRNA，SOCS3 mRNA表達(dá)上調(diào)，抑制JAK2可減輕

18、神經(jīng)痛大鼠的機(jī)械性痛覺超敏，緩解脊髓的神經(jīng)炎癥反應(yīng)，鞘內(nèi)注射ATL可降低p-STAT3表達(dá)，提高SOCS3 mRNA表達(dá)，提示脊髓JAK2-STAT3-SOCS3信號通路參與神經(jīng)痛的過程。
　　3.電針可提高神經(jīng)痛大鼠的機(jī)械痛閾和熱痛閾，并提高脊髓5-LO和AnnexinA1 mRNA水平的表達(dá)，鞘內(nèi)注射BOC-2可拮抗電針的鎮(zhèn)痛作用，以上結(jié)果提示，電針可能通過提高神經(jīng)痛大鼠體內(nèi)ALX配體物質(zhì)含量，與ALX特異性結(jié)合后，降低脊髓炎