脊髓白介素-1β在大鼠炎癥痛及電針鎮(zhèn)痛中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、炎癥痛是最常見(jiàn)的病理性疼痛之一，是由多種原因(包括創(chuàng)傷、細(xì)菌、病毒感染以及外科手術(shù))導(dǎo)致外周組織受損所引起的持續(xù)性的疼痛狀態(tài)。 白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)是一種重要的炎性細(xì)胞因子，可作用于機(jī)體的各個(gè)系統(tǒng)，具有廣泛的生物學(xué)活性。白介素-1 受體(Interleukin-1 receptor，IL-1R)有兩種形式：Ⅰ型受體(IL-1RI)和Ⅱ型受體(IL-1RII)。白介素-1β主要通過(guò)與lL-1RI

2、結(jié)合而發(fā)揮作用。 蛋白激酶D(protein kinase D，PKD)是一種新型絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶。研究表明，PKD可直接磷酸化辣椒素受體(VR1)，并增強(qiáng)VR1的功能。而VR1是痛覺(jué)信息的整合器，在介導(dǎo)炎性痛敏中發(fā)揮著重要作用，提示PKD可能在炎性痛敏的發(fā)生和維持中也發(fā)揮著重要作用。IL-1β可以通過(guò)激活蛋白激酶 C(PKC)發(fā)揮作用，而PKD也大多由PKC激活。那么PKD是否參與了IL-1β的痛覺(jué)信號(hào)通路呢?作為信號(hào)通

3、路的下游分子，p38及核因子κB(NF-κB)可被IL-1β激活，并調(diào)控痛覺(jué)相關(guān)物質(zhì)(如IL-6、TNF-α、COX-2等)的基因表達(dá)，在痛覺(jué)調(diào)制中發(fā)揮著重要作用。那么，IL-1β對(duì)它們的調(diào)控與PKD之間又是否存在著密切聯(lián)系呢?因此，探討IL-1β痛覺(jué)信號(hào)通路中PKD的作用及PKD的上、下游信號(hào)分子，以揭示IL-1β在炎癥痛中的作用機(jī)制，也是本文研究的另一主要內(nèi)容。 本文在角叉菜膠建立的大鼠單側(cè)足底炎癥痛模型上，從整體到離體等不

4、同水平，采用行為學(xué)、RT-PCR、Western blot、ELISA、免疫化學(xué)染色以及神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染等技術(shù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 1．電針對(duì)炎癥痛大鼠痛閾及脊髓IL-1β、IL-1RI表達(dá)的影響 1.1 角叉菜膠注射引起的炎性痛敏反應(yīng)大鼠左側(cè)足掌注射2％角叉菜膠100μl，分別于注射前及注射后105至300min內(nèi)，測(cè)量注射爪及未注射爪的縮爪潛伏期(PWL)。 1.2 電針對(duì)炎癥痛大鼠痛閾的影響大鼠隨機(jī)分成4組：

5、正常組(Normal)、角叉菜膠組(Carrageenan)、角叉菜膠+電針組(Carrageenan+EA)、角叉菜膠+假電針組(Carrageenanq+sham EA)。 1.3 電針對(duì)炎癥痛大鼠脊髓IL-1β表達(dá)的影響實(shí)驗(yàn)分組同上。 1.4 電針對(duì)炎癥痛大鼠脊髓IL-1RI表達(dá)的影響實(shí)驗(yàn)分組同上。 小結(jié)： 大鼠足掌注射角叉菜膠可誘發(fā)炎癥痛；電針對(duì)炎癥痛大鼠有顯著鎮(zhèn)痛作用；炎癥痛時(shí)大鼠脊髓lL-1β

6、及IL-1RI表達(dá)明顯增加；電針可降低炎癥痛誘導(dǎo)的IL-1β及IL-1RI表達(dá)。 2．應(yīng)用反義寡核苷酸技術(shù)下調(diào)IL-1RI表達(dá)對(duì)大鼠炎癥痛及電針鎮(zhèn)痛的影響 2.1 鞘內(nèi)注射IL-1RI的反義寡核苷酸對(duì)脊髓IL-1RI表達(dá)的影響大鼠隨機(jī)分為3組，各組大鼠行鞘內(nèi)插管后，分別給予針對(duì)IL-1RI的反義寡核苷酸(Antisense組)、正義寡核苷酸(Sense組)以及生理鹽水(NS組)。 2.2 鞘內(nèi)注射IL-1RI的反

7、義寡核苷酸及與電針合用對(duì)脊髓IL-1β表達(dá)的影響大鼠隨機(jī)分為5組，各組大鼠行鞘內(nèi)插管后，分別給予針對(duì)IL-1RI的反義寡核苷酸(antisense組)及生理鹽水(NS組)。 2.3 鞘內(nèi)注射IL-IRI的反義寡核苷酸對(duì)正常大鼠痛閾的影響大鼠隨機(jī)分為3組，各組大鼠行鞘內(nèi)插管后，分別給予針對(duì)IL-1RI的反義寡核苷酸(Antisense組)、正義寡核苷酸(Sense組)以及生理鹽水(NS組)。 2.4 鞘內(nèi)注射IL-1RI的

8、反義寡核苷酸對(duì)炎癥痛大鼠痛閾的影響實(shí)驗(yàn)分組同上。給藥劑量同前，每天給藥一次，連續(xù)給藥3天。 2.5 IL-1RI的反義寡核苷酸與電針合用對(duì)炎癥痛大鼠痛閾的影響大鼠隨機(jī)分為4組：反義寡核苷酸+電針組(Antisense+EA)、反義寡核苷酸組(Antisense)、生理鹽水+電針組(NS+EA)以及正義寡核苷酸+電針組(Sense+EA)。 小結(jié)： 鞘內(nèi)注射IL-lRI的反義寡核苷酸明顯下調(diào)脊髓IL-1RI表達(dá)，但

9、對(duì)IL-1β表達(dá)無(wú)明顯影響；下調(diào)脊髓IL-IRI表達(dá)對(duì)正常大鼠痛閾無(wú)顯著影響，但能明顯提高炎癥痛大鼠痛閾；IL-1RI的反義寡核苷酸與電針合用進(jìn)一步提高炎癥痛大鼠痛閾。 3．炎癥痛及電針鎮(zhèn)痛時(shí)PKD在IL-1β痛覺(jué)信號(hào)通路中的作用 3.1 角叉菜膠及電針對(duì)脊髓PKD表達(dá)及活性的影響大鼠隨機(jī)分為4組：正常組(Normal)、角叉菜膠組(Carrageenan)、角叉菜膠+電針組(Carrageenan+EA)及角叉菜膠+假

10、電針組(Carrageenan+shamEA)。 3.2 脂多糖(LPS)對(duì)原代培養(yǎng)脊髓神經(jīng)元中IL-1β表達(dá)的影響為進(jìn)一步研究PKD在IL-1β痛覺(jué)信號(hào)通路中的作用，本課題應(yīng)用了離體脊髓神經(jīng)元原代培養(yǎng)技術(shù)。 3.3 LPS對(duì)原代培養(yǎng)脊髓神經(jīng)元中PKD表達(dá)及活性的影響在原代培養(yǎng)10天的神經(jīng)元培養(yǎng)液中，加入LPS分別刺激0.5、1、3、8、12h 后，分析脊髓神經(jīng)元中PKD表達(dá)及活性變化。 3.4 白介素-1受體拮

11、抗劑(IL-1Ra)對(duì)LPS誘導(dǎo)PKD活化的影響在原代培養(yǎng)10天的神經(jīng)元培養(yǎng)液中，加入LPS及不同劑量的IL-1Ra(56-1000nM)共同孵育8 h，分析脊髓神經(jīng)元中PKD活性及表達(dá)的變化。 小結(jié)： 正常大鼠脊髓中存在少量的PKD磷酸化，炎癥痛時(shí)PKD活性升高，電針可使其降低；原代培養(yǎng)的大鼠脊髓神經(jīng)元中，LPS可時(shí)程依賴性地誘導(dǎo)IL-1β及磷酸化PKD表達(dá)；IL-1Ra可劑量依賴性地抑制LPS誘導(dǎo)的PKD磷酸化。

12、 4.PKC及p38、NF-κB在IL-1β/PKD信號(hào)通路中的作用 4.1 LPS對(duì)原代培養(yǎng)脊髓神經(jīng)元中PKC活性的影響在原代培養(yǎng)10天的神經(jīng)元培養(yǎng)液中，加入LPS分別刺激0.5、1、3、8、12h后，分析脊髓神經(jīng)元中PKC活性的變化。 4.2 IL-1Ra對(duì)LPS誘導(dǎo)PKC活化的影響在原代培養(yǎng)10天的神經(jīng)元培養(yǎng)液中，加入LPS及不同劑量的IL-1Ra(50-1000nM) 共同孵育8 h，提取細(xì)胞蛋白，分析脊髓神

13、經(jīng)元中PKC活性的變化。 4.3 PKC抑制劑對(duì)LPS誘導(dǎo)PKD活化的影響為明確PKD是否由PKC激活，在原代培養(yǎng)10天的神經(jīng)元培養(yǎng)液中，加入LPS 刺激 7h 后，再加入Ro-32-0432(一種選擇性PKC抑制劑，主要針對(duì)PKCα和 PKCβ，100 nM)孵育1 h。 4.4 LPS對(duì)p38及NF-κB表達(dá)的影響在原代培養(yǎng)10天的神經(jīng)元培養(yǎng)液中，加入LPS分別刺激0.5、1、3、8、12h后，分析脊髓神經(jīng)元中p38

14、及NF-κB表達(dá)的變化。 4.5 IL-1Ra對(duì)LPS誘導(dǎo)的p38活化及NF-κB表達(dá)的影響在原代培養(yǎng)10天的神經(jīng)元培養(yǎng)液中，加入LPS及不同劑量的IL-1Ra(50-1000nM)共同孵育8 h，分析脊髓神經(jīng)元中p38及NF-κB表達(dá)的變化。 4.6 PKC抑制劑對(duì)LPS誘導(dǎo)的p38活化及NF-κB表達(dá)的影響為確定PKC是否參與p38活化及NF-κB表達(dá)，以及哪種亞型參與其中，在原代培養(yǎng)10天的神經(jīng)元培養(yǎng)液中，加入LP

15、S刺激7 h后，分別加入Ro-32-0432(100 nM)及PKCl3抑制劑(100 nM)孵育1 h。 4.7 下調(diào)PKD表達(dá)對(duì)LPS誘導(dǎo)的p38活化及NF-κB表達(dá)的影響為確定PKD是否參與p38活化及NF-κB表達(dá)，在原代培養(yǎng)8天的神經(jīng)元培養(yǎng)液中，加入PKD的反義寡核苷酸(antisense，0.2μM)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，孵育48 h。 小結(jié)： 原代培養(yǎng)脊髓神經(jīng)元中，LPS可時(shí)程依賴性地誘導(dǎo)PKC、p38磷酸化及

16、NF-κB表達(dá)；IL-1Ra可劑量依賴性地抑制LPS誘導(dǎo)的PKC(pan)、PKCα/β<,II>、p38磷酸化及NF-κB表達(dá)；PKCα參與了LPS誘導(dǎo)的PKD、p38活化及NF-κB表達(dá)；下調(diào)PKD表達(dá)可抑制LPS誘導(dǎo)的p38磷酸化及NF-κB表達(dá)。 本文提示： 1.炎癥痛及電針鎮(zhèn)痛時(shí)，大鼠脊髓IL-1β及IL-IRI表達(dá)發(fā)生變化，提示脊髓內(nèi)源性IL-1β參與了角叉菜膠誘導(dǎo)的炎癥痛，電針可能通過(guò)降低脊髓IL-1β及I