靶向抑制延髓下行易化作用在大鼠骨癌痛中的鎮(zhèn)痛效應(yīng)及其機(jī)制研究.pdf

1、研究目的：
　　本研究擬通過探討從 RVM區(qū)投射到脊髓的5-HT能下行通路以及RVM區(qū)膠質(zhì)細(xì)胞在骨癌痛大鼠疼痛機(jī)制中的作用,以期尋找癌痛治療的新靶點(diǎn)和新的治療策略。
　　研究方法與結(jié)果：
　　1.骨癌痛大鼠脊髓背角5-羥色胺含量的變化及意義
　　方法:實驗一(骨癌痛大鼠脊髓背角5-HT含量與其痛閾的相關(guān)性分析):雌性SD大鼠57只,隨機(jī)分為3組,每組19只。1)正常對照組(Na?ve):不作任何處理;2)假手術(shù)組

2、(Sham):于右側(cè)脛骨上段骨髓腔注射 D-hank’s液10μl;3)骨癌痛組(CIBP):于右側(cè)脛骨上段骨髓腔接種10μl(約3×104)Walker256大鼠乳腺癌細(xì)胞懸液制備脛骨癌痛模型。實驗二(鞘內(nèi)注射5-羥色胺能選擇性神經(jīng)毒素5,7-DHT對骨癌痛大鼠痛閾的影響):雌性 SD大鼠56只,隨機(jī)分為4組,每組14只。1) Sham-Saline組:假手術(shù)后第10天鞘內(nèi)置管,第14天鞘內(nèi)給生理鹽水(20μl);2) Sham-5,

3、7-DHT組:假手術(shù)后第10天鞘內(nèi)置管,第14天鞘內(nèi)給5,7-DHT(60μg);3) CIBP-Saline組:造模后第10天鞘內(nèi)置管,第14天鞘內(nèi)給生理鹽水(20μl);4) CIBP-5,7-DHT組:造模后第10天鞘內(nèi)置管,第14天鞘內(nèi)給5,7-DHT(60μg)。采用痛覺行為學(xué)和組織病理學(xué)方法鑒定模型構(gòu)建成功。分別于術(shù)后第7、14和21天取各組大鼠脊髓背角組織,采用高效液相色譜法檢測脊髓背角組織中5-HT含量,并與相應(yīng)時點(diǎn)的機(jī)

4、械縮爪閾值和縮爪持續(xù)時間做雙變量相關(guān)分析。檢測鞘內(nèi)給予5,7-DHT對大鼠痛覺行為學(xué)的影響。采用高效液相色譜分析和免疫熒光染色檢測5,7-DHT對脊髓背角5-羥色胺能神經(jīng)的毀損效應(yīng)。
　　結(jié)果:腫瘤細(xì)胞接種后7～21 d大鼠機(jī)械縮爪閾值明顯降低,縮爪持續(xù)時間延長,移動誘發(fā)痛評分進(jìn)行性升高(P<0.05)。光鏡下腫瘤注射部位可見大量腫瘤細(xì)胞浸潤,骨組織結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞,表明模型制備成功。與對照組相比,骨癌痛組大鼠接種后7～21 d時機(jī)械

5、痛閾降低,接種后7、14和21 d時脊髓背角5-HT含量升高,且5-HT含量與機(jī)械痛閾呈顯著相關(guān)(P<0.05)。鞘內(nèi)注射5,7-DHT后可顯著降低脊髓背角中5-HT含量,并能顯著緩解骨癌痛大鼠的疼痛行為。
　　2.靶向抑制RVM區(qū)5-羥色胺能下行易化作用在骨癌痛大鼠的鎮(zhèn)痛效應(yīng)評價
　　方法:雌性 SD大鼠108只,隨機(jī)分為4組,每組27只。1)Sham-Saline組:假手術(shù)后第14天 RVM區(qū)給生理鹽水(0.5μl);2

6、)Sham-PCPA組:假手術(shù)后第14天RVM區(qū)給 PCPA(50μg);3)CIBP-Saline組:造模后第14天 RVM區(qū)給生理鹽水(0.5μl);4)CIBP-PCPA組:造模后第14天 RVM區(qū)給 PCPA(50μg)。檢測各組大鼠不同時點(diǎn)的機(jī)械縮爪閾值、縮爪持續(xù)時間和移動誘發(fā)痛評分。免疫印跡法檢測 RVM區(qū) TPH的表達(dá)。高效液相色譜法檢測 RVM給藥后不同時點(diǎn)脊髓背角5-HT含量。應(yīng)用免疫熒光染色法檢測 RVM區(qū)和脊髓背角

7、5-HT的表達(dá)。
　　結(jié)果:色氨酸羥化酶選擇性抑制劑 PCPA可下調(diào) RVM區(qū)5-HT的表達(dá),并可降低大鼠脊髓背角的5-HT含量(P<0.05)。行為學(xué)檢測發(fā)現(xiàn),RVM區(qū)注射 PCPA后大鼠觸誘發(fā)痛閾值升高,縮爪持續(xù)時間縮短且移動誘發(fā)痛評分減低(P<0.05)。免疫熒光染色結(jié)果顯示 RVM區(qū)注射 PCPA可降低脊髓背角5-HT含量。
　　3.RVM區(qū)5-羥色胺能下行易化作用參與大鼠骨癌痛的機(jī)制研究
　　方法:實驗一:雌

8、性 SD大鼠48只,隨機(jī)分為4組,每組12只。1)Sham-DMSO組:假手術(shù)后第14天 RVM區(qū)注射 DMSO(1μl);2)Sham-SB203580:假手術(shù)后第14天 RVM區(qū)注射 SB203580(50μg);3)CIBP-DMSO組:造模后第14天 RVM區(qū)注射 DMSO(1μl);4)CIBP-SB203580組:造模后第14天 RVM區(qū)注射 SB203580(50μg)。檢測各組大鼠不同時點(diǎn)的痛閾。免疫印跡法檢測 RVM區(qū)

9、給藥后 TPH的表達(dá)。高效液相色譜法分析 RVM區(qū)給藥后脊髓背角5-HT含量。應(yīng)用免疫熒光染色法分別檢測 RVM區(qū) TPH和脊髓背角5-HT的表達(dá)。實驗二:雌性 SD大鼠12只,隨機(jī)分為2組:正常對照組(Naive組,n=3)和骨癌痛組(CIBP組,n=9)。分別于模型構(gòu)建后第7、14和21d處死大鼠,取脊髓腰膨大組織進(jìn)行基因芯片檢測5-HT受體的表達(dá)。
　　結(jié)果:骨癌痛大鼠RVM區(qū)注射 p38MAPK選擇性抑制劑 SB20358

10、0后機(jī)械縮爪閾值顯著升高,縮爪持續(xù)時間明顯縮短且移動誘發(fā)痛評分顯著降低(P<0.05)。免疫蛋白印跡檢測發(fā)現(xiàn),RVM區(qū)注射 SB203580在產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用的同時顯著抑制了RVM區(qū)色氨酸羥化酶(TPH)的蛋白表達(dá)(P<0.05)。免疫熒光染色顯示 RVM區(qū)注射SB203580后 RVM區(qū) TPH染色陽性神經(jīng)元減少。高效液相色譜分析結(jié)果顯示脊髓背角5-HT的水平降低(P<0.05)?；蛐酒Y(jié)果顯示,骨癌痛大鼠脊髓中參與5-HT易化疼痛作用

11、和抑制疼痛作用的受體表達(dá)均上調(diào),但參與易化作用的受體表達(dá)高于抑制作用的受體。
　　4.RVM區(qū)膠質(zhì)細(xì)胞活化參與大鼠骨癌痛的機(jī)制研究
　　方法:雌性 SD大鼠99只,隨機(jī)分為7組:1)正常對照組(Na?ve,n=6):不做任何處理;2)假手術(shù)組(Sham,n=18):于右后肢脛骨上段骨髓腔注射 D-hank’s液10μl;3)骨癌痛組(CIBP,n=18):于右后肢脛骨上段骨髓腔注射 walker256乳腺癌細(xì)胞懸液10μl(

12、3×104個);4)假手術(shù)加生理鹽水組(sham/NS,n=15):假手術(shù)后第10天RVM注射生理鹽水0.5μl;5)骨癌痛加生理鹽水組(CIBP/NS,n=15):骨癌痛造模后第10天 RVM注射生理鹽水0.5μl;6)骨癌痛加米諾環(huán)素組(CIBP/ Minocycline,n=15):骨癌痛造模后第10天 RVM注射小膠質(zhì)細(xì)胞抑制劑米諾環(huán)素0.5μl(25μg);7)骨癌痛加氟代檸檬酸組(CIBP/ Fluorocitrate,n=

13、12):骨癌痛模型構(gòu)建后第10天 RVM注射星形膠質(zhì)細(xì)胞抑制劑氟代檸檬酸1μg。應(yīng)用影像學(xué)方法檢測骨癌痛大鼠脛骨骨質(zhì)的破壞情況。熒光定量 PCR法檢測 RVM區(qū)膠質(zhì)細(xì)胞活化標(biāo)志物 mRNA表達(dá)的變化。Western-blot和免疫熒光染色檢測不同藥物處理對 RVM膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響。痛覺行為學(xué)檢測不同藥物處理后大鼠痛閾的改變。熒光定量 PCR法檢測 RVM給予小膠質(zhì)細(xì)胞抑制劑后促炎性介質(zhì) IL-1β、IL-6、TNF-α和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)

14、因子(BDNF)的表達(dá)。
　　結(jié)果:骨癌痛大鼠RVM區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞顯著活化,且小膠質(zhì)細(xì)胞釋放的促炎性介質(zhì) IL-1β、IL-6、TNF-α和BDNF表達(dá)升高(P<0.05)。RVM區(qū)注射小膠質(zhì)細(xì)胞抑制劑和星形膠質(zhì)細(xì)胞抑制劑可分別抑制小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化,并能呈時間依賴性的緩解骨癌痛大鼠的疼痛。RVM區(qū)注射小膠質(zhì)細(xì)胞抑制劑可逆轉(zhuǎn)小膠質(zhì)細(xì)胞釋放的促炎性介質(zhì)的高表達(dá),并能有效地緩解骨癌痛大鼠的疼痛。
　　5統(tǒng)

15、計學(xué)處理
　　采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( x±s)表示;兩組數(shù)據(jù)之間比較采用t檢驗,多組數(shù)據(jù)之間比較采用方差分析(ANOVA),分析后post-hoc檢驗采用Student-Newman–Keuls test,脊髓背角5-HT含量與機(jī)械痛閾進(jìn)行雙變量相關(guān)分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　研究結(jié)論：
　　1.RVM區(qū)5-羥色胺能下行易化作用參與了大鼠骨癌痛的維持，其機(jī)制包