腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子在大鼠骨癌痛中的作用及其神經(jīng)免疫機制.pdf

1、基于我室改良的骨癌痛模型表明，脊髓P2X4特異性存在于小膠質(zhì)細(xì)胞表面，且其參與骨癌痛大鼠痛覺過敏的形成。此外，近年來研究表明，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derivedneurotrophicfactor，BDNF)是神經(jīng)元—膠質(zhì)細(xì)胞間”對話”的重要信號分子，這一神經(jīng)痛后異常分泌的BDNF是由小膠質(zhì)細(xì)胞上P2X4激活實現(xiàn)的。作為與神經(jīng)痛相似又有其獨特性的疼痛，骨癌痛狀態(tài)下尚未發(fā)現(xiàn)存在類似BDNF介導(dǎo)的改變。據(jù)此，我們推測，脊髓小膠質(zhì)

2、細(xì)胞P2X4受體激活介導(dǎo)的BDNF釋放可能參與骨癌痛痛敏的發(fā)生。本研究將結(jié)合在體、離體實驗，采用siRNA、行為學(xué)，real-timePCR，WestemBlot，ELISA，免疫組化等方法，通過分子水平(P2X4受體和BDNF)、細(xì)胞水平（小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元）以及整體水平（免疫和感覺系統(tǒng)）的”對話”來初探疼痛的神經(jīng)免疫機制。
　　 第一部分，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子參與大鼠骨癌痛的發(fā)生
　　 目的和方法：探討腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因

3、子（Brain-derivedneurotrophicfactor，BDNF）在大鼠骨癌痛發(fā)生中的作用及其神經(jīng)免疫機制。應(yīng)用Walker256乳腺癌細(xì)胞種植于大鼠一側(cè)脛骨髓腔，建立骨癌痛模型，并通過疼痛行為學(xué)、影像學(xué)、病理組織學(xué)等評估腫瘤及疼痛發(fā)生發(fā)展情況；以下按照下述研究目的進行相應(yīng)的實驗分組，并分別采用疼痛行為學(xué)(n=10)，Westernblots(n=4)，Real-timePCR(n=4)，免疫組織化學(xué)(n=4)，小RNA干擾

4、(smallinterferingRNA，siRNA，n=4)技術(shù)以及磺基羅丹明B(sulforhodamineB，SRB)方法(n=6)進行研究：①觀察骨癌痛大鼠脊髓及背根神經(jīng)節(jié)(DRG)BDNF表達(dá)產(chǎn)物的變化；②觀察小膠質(zhì)細(xì)胞抑制劑米絡(luò)環(huán)素對骨癌痛大鼠脊髓BDNF表達(dá)的調(diào)節(jié)作用及其鎮(zhèn)痛效應(yīng)；③研究BDNF中和抗體對大鼠骨癌痛的鎮(zhèn)痛效應(yīng)及其下游磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(phosphorylationofextracellul

5、arsignal-regulatedproteinkinase1/2，p-ERK1/2)機制；④針對小膠質(zhì)細(xì)胞上BDNF表達(dá)的siRNA篩選及轉(zhuǎn)染復(fù)合物的毒性檢測；⑤觀察BDNFsiRNA對骨癌痛大鼠的鎮(zhèn)痛效應(yīng)及其可能機制。結(jié)果：①骨癌痛大鼠L4～6脊髓后角和DRG的BDNFmRNA及蛋白表達(dá)均增加，且峰值在造模后第6天(n=4，P＜0.01)；②早期（造模后第4～6天連續(xù)注射）鞘內(nèi)注射米諾環(huán)素可明顯減緩大鼠骨癌痛（機械撤爪閾值PWT及

6、行走評分ambulatoryscores）(n=10，P＜0.01)；并減緩骨癌痛大鼠脊髓后角的OX-42（小膠質(zhì)細(xì)胞激活標(biāo)志物）和BDNF的表達(dá)；而晚期給藥（造模后第10～12天連續(xù)注射）則無顯著作用；熒光免疫組化顯示，造模后第6天，骨癌痛大鼠L4～6脊髓后角OX-42表達(dá)上調(diào)；且OX-42/BDNF雙標(biāo)產(chǎn)物也上調(diào)。③鞘內(nèi)注射BDNF中和抗體減緩骨癌痛大鼠機械痛敏(機械撤爪閾值PWT)(n=10，P＜0.01)；并顯著減少脊髓BDNF

7、和p-ERK1/2的蛋白表達(dá)(n=4，均P＜0.01)；④LipofectamineTM20008μl復(fù)合100nmolsiRNA（脂質(zhì)體與siRNA比例為1∶3），不僅細(xì)胞毒性低而且轉(zhuǎn)染效率高(n=6，P＜0.01)，為最佳轉(zhuǎn)染條件；與陰性對照組及siRNA283、siRNA232相比，BDNFsiRNA1588(100nmol，脂質(zhì)體與siRNA比例1∶3)干擾小膠質(zhì)細(xì)胞后，其mRNA和蛋白的相對表達(dá)量最低(n=6，P＜0.01)。

8、⑤與對照組相比，早期（造模后第4～6天連續(xù)注射）鞘內(nèi)注射BDNFsiRNA可明顯減緩大鼠骨癌痛（機械撤爪閾值PWT及行走評分ambulatoryscores）；而晚期給藥（造模后第10～12天連續(xù)注射）也有鎮(zhèn)痛作用，但是沒有早期給藥明顯；單次給藥后鎮(zhèn)痛持續(xù)約24h，高峰在約4h左右；鞘內(nèi)注射外源性BDNF的致痛作用可能通過BDNF-trkB途徑介導(dǎo)。結(jié)論：BDNF可能與其受體trkB結(jié)合后，通過下游的MAPK/ERK1/2途徑參與大鼠骨

9、癌痛的發(fā)生和維持。
　　 第二部分，BDNF通過調(diào)控神經(jīng)元NMDA受體功能參與大鼠骨癌痛的發(fā)展
　　 目的和方法：探討腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain-derivedneurotrophicfactor，BDNF)是否可以通過調(diào)控神經(jīng)元N-甲基-D-門冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受體功能參與大鼠骨癌痛的發(fā)展。建立大鼠骨癌痛模型，并按照下述研究目的進行相應(yīng)的實驗分組，分別采用疼痛行為學(xué)(n=8

10、)，Real-timePCR(n=4)，免疫組織化學(xué)（n=4）及小RNA干擾(smallinterferingRNA，siRNA，n=4)技術(shù)進行以下研究：(D觀察骨癌痛大鼠脊髓及背根神經(jīng)節(jié)(DRG)磷酸化的NMDA受體亞型NR1（p-NR1）表達(dá)產(chǎn)物的變化；②觀察鞘內(nèi)注射BDNFsiRNA對骨癌痛大鼠脊髓及背根神經(jīng)節(jié)(DRG)BDNF及p-NR1表達(dá)的調(diào)節(jié)作用及其鎮(zhèn)痛效應(yīng)；③觀察BDNF是否通過TrkB受體調(diào)控NMDA受體功能。結(jié)果：

11、①骨癌痛大鼠L4～6脊髓后角和DRG的p-NR1mRNA及蛋白表達(dá)均增加，且峰值在造模后第9天（n=4，P＜0.01）；②與對照組相比，造模后第9天，鞘內(nèi)注射BDNFsiRNA（造模后第4～6天連續(xù)注射）可明顯減少骨癌痛大鼠L4～6脊髓后角和DRG的BDNF和NR1mRNA表達(dá)，并減少p-NR1蛋白表達(dá)(n=4，P＜0.01)；③正常大鼠鞘內(nèi)注射NMDA可誘發(fā)痛行為反應(yīng)，持續(xù)155s(n=8，P＜0.01)；BDNF受體trkB的中和抗

12、體trkB-IgG預(yù)注射可明顯減緩NMDA誘發(fā)的痛行為反應(yīng)(n=8，P＜0.01)；而BDNF則可增強該NMDA誘發(fā)的瘸行為反應(yīng)。結(jié)論：BDNF可能與其受體trkB結(jié)合后，通過調(diào)控神經(jīng)元NMDA受體功能參與大鼠骨癌痛的發(fā)展。
　　 第三部分，小膠質(zhì)細(xì)胞上P2X4R激活介導(dǎo)的BDNF釋放參與大鼠骨癌痛的發(fā)生
　　 目的和方法：探討小膠質(zhì)細(xì)胞上P2X4受體(P2X4R)激活是否可班介導(dǎo)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（Brain-deri

13、vedneurotrophicfactor，BDNF）的釋放及參與大鼠骨癌痛的發(fā)生。體外培養(yǎng)大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞，并建立大鼠骨癌痛模型，按照下述研究目的進行相應(yīng)的實驗分組，分別采用疼痛行為學(xué)(n=10)，Westemblots(n=4)，Real-timePCR(n=4)，免疫組織化學(xué)(n=4)及ELISA方法(n=4)進行以下研究：①針對小膠質(zhì)細(xì)胞上P2X4R表達(dá)的siRNA體外篩選；②觀察體外小膠質(zhì)細(xì)胞上P2X4R的激活是否可以通過P38

14、MAPK機制介導(dǎo)BDNF的分泌和釋放；③觀察骨癌痛大鼠脊髓P2X4R、磷酸化的p38MAPK(p-p38)表達(dá)變化；P2X4R/p-p38、P2X4R/BDNF共表達(dá)及BDNF、TNFα、IL-1β分泌的變化；④觀察鞘內(nèi)注射P2X4siRNA對骨癌痛大鼠P2X4R、p-p38表達(dá)及BDNF、TNFα、IL-1β分泌的調(diào)節(jié)作用及其鎮(zhèn)痛效應(yīng)。結(jié)果：①與對照組相比，轉(zhuǎn)染后24h，小膠質(zhì)細(xì)胞P2X4RmRNA表達(dá)明顯減少；轉(zhuǎn)染后48h，P2X4

15、R蛋白表達(dá)也較對照組明顯減少(n=4，P＜0.01)；②ATP可能可以通過p38的激活，介導(dǎo)體外培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞的BDNF合成和釋放，且該作用在ATP刺激后60min達(dá)到高峰(n=4，P＜0.01)，并依賴于P2X4R；③骨癌痛大鼠L4～6脊髓后角的P2X4R蛋白和mRNA表達(dá)均增加，且呈現(xiàn)進行性增加趨勢，峰值在造模后第18天(n=4，P＜0.01)；骨癌痛大鼠L4～6脊髓后角的p-p38蛋白表達(dá)，以及BDNF，TNFα和IL-1β的分泌

16、均明顯增加，且峰值在造模后第6天(n=4，P＜0.01)；熒光雙標(biāo)免疫組化顯示，造模后第6天，骨癌痛大鼠L4～6脊髓后角P2X4R/BDNF和P2X4R/p-p38雙標(biāo)產(chǎn)物均明顯上調(diào)；④與對照組相比，造模后鞘內(nèi)注射P2X4RsiRNA(第4～6天連續(xù)注射)可明顯減緩大鼠骨癌痛（機械撤爪閾值PWT及行走評分ambulatoryscores）(n=10，P＜0.01)；并可明顯減少骨癌痛大鼠p-p38，BDNF，TNFα和IL-1β表達(dá)(n