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文檔簡介
1、第一章背根神經(jīng)節(jié)proBDNF在大鼠后足切割后的表達(dá)及作用
目的:觀察大鼠后足切割后proBDNF表達(dá)變化及對(duì)切割疼痛的影響。
方法:采用縱行切割SD大鼠后足作為疼痛模型,運(yùn)用免疫熒光雙標(biāo)記方法,觀察大鼠后足切割后不同時(shí)間點(diǎn)(1-72 hr)proBDNF在相應(yīng)節(jié)段背根神經(jīng)節(jié)的表達(dá)變化。腹腔注射proBDNF抗體中和內(nèi)源性proBDNF后,以Von Frey尼龍纖維刺激后足行機(jī)械痛敏評(píng)價(jià)。
結(jié)果
2、:大鼠后足切割后1-24 hr內(nèi),proBDNF在切割同側(cè)背根神經(jīng)節(jié)表達(dá)上調(diào),proBNDF免疫陽性細(xì)胞百分比在切割后1-24 hr內(nèi)也明顯增加。腹腔內(nèi)給予proBDNF抗體明顯增加大鼠后足切割后的縮足閾值。
結(jié)論:大鼠后足切割后背根神經(jīng)節(jié)proBDNF表達(dá)上調(diào),proBDNF參與了大鼠后足切割后機(jī)械痛敏的過程。
第二章 proBDNF腺病毒載體的構(gòu)建及鑒定
目的:構(gòu)建腺病毒介導(dǎo)的proBDNF
3、基因用于活體組織的研究。
方法:從提供的模板中利用PCR方法釣取目的基因,而后將目的載體進(jìn)行酶切,產(chǎn)物電泳回收后進(jìn)行交換,再把交換產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞。然后對(duì)長出的克隆先進(jìn)行菌落PCR鑒定,再進(jìn)行測序和比對(duì)分析。測序正確后,采用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞24小時(shí)后,用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)變化。從菌落中收集生長狀態(tài)良好的目的細(xì)胞,提取蛋白,采用Western Blot的方法檢測目的基因
4、的表達(dá)情況。采用AdMax腺病毒包裝系統(tǒng)包括腺病毒穿梭質(zhì)粒和輔助包裝質(zhì)粒(pBHG lox△E1,3 Cre)共同轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,再對(duì)pDC315-proBDNF病毒擴(kuò)增、提純和Western Blot檢測。
結(jié)果:所構(gòu)建的pDC315-proBDNF重組腺病毒經(jīng)酶切、PCR和Western Blot鑒定成功的轉(zhuǎn)化了proBDNF,基因片段大小為741bp。原代病毒滴度為8.0×109 PFU/mL,proBDNF在
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