神經(jīng)生長因子在離體大鼠心肌缺血再灌注損傷中的作用及其非神經(jīng)機制的研究.pdf

1、目的: 通過檢測神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）在大鼠離體心臟缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury，I/R)不同損傷程度的表達變化，進一步研究不同濃度外源性神經(jīng)生長因子β對心臟缺血再灌注損傷的影響，并給予PI3K-Akt通路的阻斷劑，以期探討神經(jīng)生長因子與大鼠心臟缺血再灌注損傷程度的關(guān)系、作用及可能機制。
　　方法
　　第一部分健康SPF級雄性SD大鼠48只，8

2、～10周齡，體重200～300 g，制備離體Langendorff心臟灌注模型后，采用隨機數(shù)字表法，將離體心臟隨機分為6組(n=8):假手術(shù)組（S組）、缺血組（I組）、缺血再灌注組（I/R組）、神經(jīng)生長因子0.025組（N0.025組）、神經(jīng)生長因子0.1組（N0.1組）、神經(jīng)生長因子0.4組(N0.4組)。各組均先用K-H液平衡灌注20 min，S組用K-H液繼續(xù)灌注180 min;I組灌注K-H液30 min，停灌30 min;缺血

3、再灌注組灌注K-H液30min，停灌30 min，復(fù)灌120 min; N0.1組用含有0.1 ng/ml神經(jīng)生長因子的K-H液繼續(xù)灌注20 min，再用K-H液沖洗10 min，停灌30min，復(fù)灌120 min; N0.025組和N0.4組灌注液中的神經(jīng)生長因子濃度分別為0.025、0.4 ng/ml，灌注方式同N0.1組。待心臟跳動穩(wěn)定后，于左心耳處插入乳膠水囊至左心室，用SCW-PTO1型壓力傳感器與RM6240B型多通道信號采

4、集處理系統(tǒng)在平衡灌注末(T1)、停灌前即刻(T3)及再灌后5 min(T4)、30 min(T5)、60 min(T6)、120 min(T7)時記錄各組的心率（HR）、左室舒張末壓(LVEDP)、左室發(fā)展壓(LVDP)、左心室內(nèi)壓最大上升速率(+dp/dtmax)。在T1、T4、T5、T6、T7各時間點收集冠脈流出液，測定肌酸激酶(CK-MB)和乳酸脫氫酶(LDH)的水平，并于再灌注末取心肌組織，TUNEL法檢測細胞凋亡，計算凋亡指數(shù)

5、。用Western-blot法檢測S組、I組、I/R組左心室前壁的神經(jīng)生長因子的表達;逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測其NGF mRNA的表達。
　　第二部分健康SPF級雄性SD大鼠32只，鼠齡8～10周，體重200～300 g，制備離體Langendorff心臟灌注模型后，采用隨機數(shù)字表法，將離體心臟隨機分為4組(n=8):對照組（缺血再灌注組，即I/R組）、NGF預(yù)處理組（N組）、LY294002組（L組）、NGF+L

6、Y294002組（N+L組）。各組先用K-H液平衡灌注20 min。隨后對照組K-H液繼續(xù)灌注60 min，停灌30min，復(fù)灌120 min;N組用含有0.1 ng/mlNGF的K-H液繼續(xù)灌注20 min，K-H液灌注40 min，再停灌30min，再灌注120 min;L組用含有LY294002(1.5 mg/kg)的K-H液持續(xù)灌注20 min，再用K-H液灌注40 min，停灌30 min，復(fù)灌120min; N+L組先用含有

7、LY294002(1.5 mg/kg)的K-H液持續(xù)灌注20min，K-H液沖洗10 min后再用含有0.1 ng/ml神經(jīng)生長因子的K-H液繼續(xù)灌注20 min，K-H液沖洗10 min，停灌30 min，再灌注120min。分別在平衡灌注末(T1)、灌注30 min和60 min(T2、T3)以及再灌注5(T4)、30(T5)、60(T6)和120 min(T7)時記錄各組的心功能指標(biāo)（同第一部分）。在T1、T2、T4、T5、T6、

8、T7各時間點收集冠脈流出液，測定肌酸激酶(CK-MB)和乳酸脫氫酶(LDH)的水平。用酶聯(lián)免疫法檢測再灌注末左心室前壁處心肌組織的丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD);一部分左心室前壁處心肌組織用TUNEL法檢測細胞凋亡，計算凋亡指數(shù);另一部分左心室前壁處心肌組織采用Western-blot法檢測不同組別Akt、pAkt、GRP78的表達;逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測各組Akt mRNA、GRP78 mRNA表達。

9、r>　　結(jié)果:
　　第一部分與平衡灌注末相比，I/R組再灌注5 min、再灌注30min的LVDP、HR、+dp/dtmax降低，LVEDP升高(P＜0.05)，而S組四者在以上三個時間點無統(tǒng)計學(xué)差異;與S組相比，I/R組再灌注5 rin、再灌注30 min的LVDP、+dp/dtmax和HR降低，LVEDP升高（P＜0.05）。與S組相比，I組和I/R組的LDH、CK升高（P＜0.05），以及NGF蛋白含量和NGF mRNA降低

10、(P＜0.05);與I組相比，I/R組心肌組織NGF蛋白和NGF mRNA減少(P＜0.05)。與T1時間點比較，I/R組、N0.025、N0.1組、N0.4組的T4、T5、T6、T7時LVDP、+dp/dtmax降低，LVEDP升高，而I/R組、N0.025組和N0.4組HR降低，N0.1組HR升高（P＜0.05）;與I/R組相比，N0.1組T3、T4、T5、T6、 T7時LVDP、+dp/dtmax和HR上升，LVEDP降低（P＜0

11、.05），N0.025組LVEDP在T1、T3、T4、T5、T6、T7差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，HR在T3、T4下降，T1、T5、T6差異無統(tǒng)計學(xué)意義，LVDP和+dp/dtmax在T3、T4、T5、T6、T7下降，T1差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），N0.4組T3、T4、T5、T6、T7時LVDP、+dp/dtmax降低，LVEDP上升（P＜0.05），T1時各指標(biāo)變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與N0.1組相比，N0.025組和N0.4組T3、T

12、4、T5、T6、T7時LVDP、+dp/dtmax和HR降低，LVEDP升高（P＜0.05）。與I/R組比較，N0.1組冠脈流出液CK、LDH在T4、T5、T6、T7四個時間點均降低，N0.025組T5、T6、T7三個時間點均升高，N0.4組T4、T5、T6、T7四個時間點均升高（P＜0.05）。各組T5時冠脈流出液CK、LDH濃度最高，隨后逐漸降低。與對照組比較N0.1組細胞凋亡指數(shù)降低（P＜0.05），N0.025組差異無統(tǒng)計學(xué)意義

13、，N0.4組升高（P＜0.05）。
　　第二部分除了N組，其余各組，與T1時比較，T4、T5、T6、T7各組LVDP、HR和+dp/dtmax均降低，LVEDP升高(P＜0.05)，N組LVDP、HR和+dp/dtmax均升高，LVEDP降低(P＜0.05)。與I/R組相比，N0.1組T2、 T3、 T4、 T5、 T6、T7時LVDP、+dp/dtmax和HR上升，LVEDP降低(P＜0.05);N+L組T3時刻LVDP、+dp

14、/dtmax和HR上升，LVEDP降低(P＜0.05)，其余各時點差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);而L組各指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與N組相比，各組HR、LVDP、+dp/dtmax在T2、T3、T4、T5、T6、T7時刻均降低，LVEDP上升(P＜0.05)。與T1相比較，四組各組的冠脈流出液CK、LDH濃度在T4、T5、T6、T7均上升，且T5時均達到最高，隨著再灌注時間的延長，濃度逐漸降低。與I/R組比較，N組冠脈流出液CK、LDH

15、濃度在T2、T3、T4、T5、T6、T7時間點均降低;N+L組冠脈流出液CK、LDH濃度在T3時間點降低，其余時間點差異無統(tǒng)計學(xué)意義;L組無統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與I/R組比較，N組心肌組織SOD濃度升高，MDA濃度下降（P＜0.05）;L組和N+L組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05）。與I/R組比較，N組凋亡指數(shù)均降低;L組和N+L組無統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。相對于I/R組，N組Akt、pAkt、GRP78蛋白表達量和Akt

16、mRNA升高(P＜0.05)，GRP78 mRNA變化無統(tǒng)計學(xué)意義;L組四者蛋白表達和基因變化均無統(tǒng)計學(xué)意義;N+L組的Akt、pAkt、GRP78蛋白表達量和Akt mRNA下降(P＜0.05)。
　　結(jié)論: (1)大鼠離體心肌缺血再灌注損傷模型中NGF的表達量與損傷程度有關(guān)，其表達越低，損傷越嚴重。(2)0.1 ng/ml的外源性神經(jīng)生長因子預(yù)處理可減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷，0.4 ng/ml時反而會加重心肌損傷。(3)外源