血小板源性生長因子-BB在缺氧心肌細(xì)胞中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、心肌細(xì)胞對缺氧性損傷的耐受差，缺氧會導(dǎo)致心臟電活動的異常、心肌細(xì)胞壞死、細(xì)胞凋亡。臨床治療心肌缺血缺氧多依賴藥物進(jìn)行有限的緩解，缺血缺氧導(dǎo)致的心功能損害亦不能得到足夠改善，開展缺血缺氧心肌損害發(fā)生機(jī)制研究，尋找新的心臟功能修復(fù)策略是亟待解決的科學(xué)問題。
　　血小板源性生長因子(Platelet derived growth factor, PDGF)是一種重要的生長因子，家族成員包括PDGF-AA，PDGF-AB，PDGF-BB，

2、PDGF-CC及PDGF-DD。在生理狀態(tài)下，PDGF貯存于血小板中，當(dāng)組織受損時，存貯于內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等細(xì)胞中的PDGF亦會釋放，其生物學(xué)特征主要促細(xì)胞分裂效應(yīng)、趨化性和血管收縮效應(yīng)，在PDGF家族中，PDGF-BB與心血管系統(tǒng)疾病的聯(lián)系最為密切。細(xì)胞凋亡是心功能障礙、心律失常、血流動力學(xué)障礙的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)，缺血缺氧可通過多條途徑對心肌細(xì)胞的產(chǎn)生損傷，從而導(dǎo)致心肌細(xì)胞壞死或凋亡。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)缺氧可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，PDG

3、F-BB可能存在的有益心肌的作用是否是通過阻止細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的尚不明確。因此，需要明確心肌細(xì)胞缺氧后內(nèi)源性PDGF-BB的變化規(guī)律，從而進(jìn)一步探討PDGF-BB對于在缺氧條件下體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞保護(hù)作用。
　　目前，通過基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)使PDGF-BB在細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)已有報道，但表達(dá)效率仍需改進(jìn)?；蜣D(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)是將純化的外源目的基因轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)，表達(dá)具有生物學(xué)功能的蛋白。病毒載體法是目前最有效的基因?qū)敕绞健?br>　　HSV是與人類共存的一

4、種病毒，其中Ⅰ型單純皰疹病毒(HSV-Ⅰ)是一種基因組為152 kb的雙鏈線狀DNA病毒，其中84個已知基因中有一半是非必須基因，這些基因允許刪除，可以插入內(nèi)含子和調(diào)節(jié)序列，因此HSV-1載體可容納長達(dá)30Kb的外源基因，可改造為病毒載體。由于HSV-1具有高度的易感性，其宿主細(xì)胞廣泛，能感染分裂期或非分裂期細(xì)胞，是較為理想的載體，用于轉(zhuǎn)基因載體治療人類疾病有良好的應(yīng)用前景。
　　本文從以下幾個方面進(jìn)行論述：
　　第一部分

5、缺氧對心肌細(xì)胞血小板源性生長因子-BB的表達(dá)調(diào)控
　　目的:觀察原代培養(yǎng)SD乳鼠心肌細(xì)胞的缺氧損傷，研究缺氧前后PDGF-BB在基因水平和蛋白水平上的表達(dá)變化，初步探討缺氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡過程中PDGF-BB的變化規(guī)律。
　　方法：
　　1.原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)及心肌細(xì)胞缺氧模型的建立
　　取新生2-3天乳鼠心室肌0.1％胰酶和0.16％Ⅱ型膠原酶進(jìn)行混合消化法進(jìn)行心肌細(xì)胞體外培養(yǎng)，隨機(jī)將培養(yǎng)的心肌細(xì)胞分為四組:正常

6、組(NC)、缺氧組3h組(H3h)、缺氧6h組(H6h)和缺氧12h組(H12h)。其中缺氧組將心肌細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行缺氧，設(shè)置條件為37℃，95％N2和5％CO2分別缺氧3h、6h和12h。
　　2.本缺氧模型對心肌細(xì)胞造成的缺氧損傷
　　觀察缺氧后心肌細(xì)胞的生長情況，建立缺氧模型后通過檢測各組心肌細(xì)胞乳酸脫氫酶(Lactate Dehydrogenase，LDH)水平評價細(xì)胞的損傷情況。使用TUNEL（脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶

7、介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記）試劑盒測定各組心肌細(xì)胞的凋亡情況。
　　3.PDGF-BB在缺氧后心肌細(xì)胞中的表達(dá)變化
　　采用免疫熒光技術(shù)確定PDGF-BB在細(xì)胞內(nèi)的定位表達(dá)，采用實(shí)時定量PCR的方法探究(Q-PCR)在缺氧損傷后PDGF-BB基因水平的表達(dá)變化;采用免疫蛋白印跡研究缺氧條件下PDGF-BB蛋白的表達(dá)變化。
　　4.數(shù)據(jù)分析
　　用實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均選用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)+標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±S

8、D)表示。各實(shí)驗(yàn)至少獨(dú)立重復(fù)3次。若方差齊用t檢驗(yàn)，方差不齊用秩和檢驗(yàn)，多組間的比較用方差分析，p＜0.05顯示有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　結(jié)果：
　　1.本實(shí)驗(yàn)中體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞純度達(dá)98％以上。常氧條件下，心肌細(xì)胞生長狀態(tài)良好，細(xì)胞飽滿。缺氧后心肌細(xì)胞膜皺縮，胞質(zhì)顆粒增加，足突減少甚至消失，細(xì)胞搏動無力且不規(guī)律。
　　2.LDH水平檢測結(jié)果顯示隨缺氧時間的延長，細(xì)胞培養(yǎng)上清的LDH值呈增加趨勢，缺氧12h組LDH較常氧組顯

9、著增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。TUNEL法檢測心肌細(xì)胞凋亡率結(jié)果顯示隨缺氧時間的延長，凋亡率呈逐漸增加趨勢，缺氧12h組心肌細(xì)胞凋亡率較常氧組顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05）。
　　3.實(shí)時定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(Q-PCR)結(jié)果顯示:缺氧12h組PDGF-BB mRNA的表達(dá)量較常氧組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（(p＜0.05)。
　　4.蛋白免疫印跡(WB)結(jié)果顯示:缺氧后12h組心肌細(xì)胞PDGF-BB蛋

10、白較常氧組顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義((p＜0.05)。
　　第二部分 血小板源性生長因子BB在心肌細(xì)胞缺氧損傷過程中的作用機(jī)制
　　目的：
　　構(gòu)建人單純皰疹病毒-1(HSV-1)PDGF-BB干擾基因重組體(NX01-U6H1-rPDGFi)，確定轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，轉(zhuǎn)導(dǎo)心肌細(xì)胞后缺氧培養(yǎng)，觀察PDGF-BB基因敲減對缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷凋亡的影響，探究內(nèi)源性PDGF-BB在心肌細(xì)胞缺氧損傷中的作用。構(gòu)建HSV-PDGF-

11、BB過表達(dá)重組體(HSV-CMV-PDGF)，轉(zhuǎn)導(dǎo)心肌細(xì)胞后缺氧培養(yǎng)，觀察過表達(dá)PDGF-BB蛋白對缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷凋亡的影響，進(jìn)一步明確PDGF-BB對心肌細(xì)胞缺氧損傷的保護(hù)作用，同時測定PI3K、AKT、ERK等信號通路蛋白，了解可能存在的信號通路機(jī)制
　　方法：
　　1.人單純皰疹病毒-1重組病毒的構(gòu)建
　　為了進(jìn)一步研究PDGF-BB在心肌細(xì)胞缺氧中的作用，我們隨后采用RT-PCR方法擴(kuò)增PDGF-BB基

12、因，同時根據(jù)PDGF-BB基因CDS設(shè)計兩條shRNA(短發(fā)卡RNA)序列，克隆HSV-PDGF-BB過表達(dá)載體，構(gòu)建HSV-PDGF-BB干擾RNA重組體。過表達(dá)及干擾RNA重組體構(gòu)建成功后將其轉(zhuǎn)導(dǎo)培養(yǎng)的心肌細(xì)胞缺氧處理，WB檢測PDGF-BB的表達(dá)水平。
　　2.過表達(dá)及低表達(dá)PDGF-BB表達(dá)對心肌細(xì)胞凋亡的影響
　　心肌細(xì)胞分為五組，常氧組(NC組)、單純?nèi)毖踅M（H組）、缺氧+空載體組（H+vector組）、缺氧+P

13、DGF-BB過表達(dá)組(H+PDGF-BB組)、缺氧+PDGF-BB低表達(dá)組(H+SiPDGF-BB組)。比較各組的LDH水平及凋亡率，判斷過表達(dá)及低表達(dá)PDGF-BB對心肌細(xì)胞凋亡的影響。
　　3.過表達(dá)PDGF-BB調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究
　　免疫印跡法檢測缺氧前后PI3K、Akt、磷酸化Akt、ERK、磷酸化ERK在蛋白水平的表達(dá)情況，比較各組之間的差異，探討過表達(dá)PDGF-BB調(diào)控缺氧心肌細(xì)胞凋亡的信號通路變化。<

14、br>　　4.數(shù)據(jù)分析
　　用實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均選用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)+標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。各實(shí)驗(yàn)至少獨(dú)立重復(fù)3次。若方差齊用t檢驗(yàn)，方差不齊用秩和檢驗(yàn)，多組間的比較用單因素方差分析，p＜0.05顯示有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　結(jié)果：
　　1.通過酶切和PCR鑒定證明成功構(gòu)建了HSV-PDGF-BB過表達(dá)及干擾RNA重組體;HSV-1病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)心肌細(xì)胞效率為80％。HSV-PDGF-BB過表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)

15、心肌細(xì)胞后缺氧培養(yǎng)PDGF-BB表達(dá)水平較空載體明顯增加(p＜0.05)，心肌細(xì)胞過表達(dá)PDGF-BB;而HSV-PDGF-BB干擾載體轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞后缺氧培養(yǎng)PDGF-BB表達(dá)水平較空載體明顯下調(diào)（p＜0.05），心肌細(xì)胞低表達(dá)PDGF-BB。
　　2.為了明確內(nèi)源性PDGF-BB在缺氧心肌細(xì)胞中的作用，我們對培養(yǎng)的心肌細(xì)胞進(jìn)行了PDGF-BB基因敲減后缺氧培養(yǎng)。結(jié)果表明，缺氧+PDGF-BB低表達(dá)組心肌細(xì)胞凋亡率及心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清L

16、DH的水平較單純?nèi)毖跫叭毖?空載體組顯著增加（p＜0.05），PDGF-BB基因敲減加重了缺氧損傷。
　　3.為進(jìn)一步研究PDGF-BB對缺氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的影響，空載體及HSV-PDGF-BB過表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)心肌細(xì)胞后缺氧，缺氧+PDGF-BB過表達(dá)組心肌細(xì)胞凋亡率及心肌細(xì)胞LDH的水平較單純?nèi)毖跫叭毖?空載體組顯著較少（p＜0.05），PDGF-BB基因過表達(dá)修復(fù)了缺氧損傷。
　　4.心肌細(xì)胞缺氧后，過表達(dá)PDGF-BB

17、組PI3K、磷酸化AKT蛋白水平較單純?nèi)毖踅M、缺氧+空載體組增高(p＜0.05)，而磷酸化ERK蛋白水平無變化(p＞0.05)，PI3K/AKT細(xì)胞通路可能參與調(diào)控PDGF-BB對心肌的保護(hù)作用。
　　結(jié)論：
　　1.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明缺氧可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷凋亡，在這個過程中伴隨著PDGF-BB表達(dá)的增加。
　　2.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)PDGF-BB具有抗缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的作用。
　　3.本研究結(jié)果提示PDGF-BB