Rho相關(guān)激酶ROCK在缺氧致心肌細胞凋亡中的表達及作用機制.pdf

1、目的：
　　 通過建立體外心肌細胞缺氧模型,觀察ROCK在不同缺氧時間點的表達,探討其在心肌細胞凋亡中的作用機制。
　　 方法：
　　 1.取健康乳鼠(出生1-3d),利用0.08％胰酶和1.00％Ⅱ型膠原酶依次消化心肌組織,混懸液經(jīng)差速貼壁2h后,加入0.1mM5-Brdu抑制成纖維細胞的生長,以1*106/ml的細胞密度接種于3.5mm的培養(yǎng)皿中,待心肌細胞生長接近會和狀態(tài)及呈現(xiàn)同步搏動時開始實驗。
　

2、　 2.利用缺氧液和缺氧盒,建立心肌細胞缺氧模型,分別缺氧培養(yǎng)1h、3h、6h、9h,以常規(guī)培養(yǎng)的心肌細胞作為對照,檢測:ROCK-1、ROCK-2的表達。
　　 3.取ROCK-1、ROCK-2表達的高峰時間點,Erk5阻斷劑PD98059(終濃度20umol/L)進行缺氧處理后,檢測相關(guān)指標的變化。
　　 4.用流式細胞儀檢測心肌細胞凋亡,MTS檢測細胞存活率,Western blotting檢測ROCK-1、RO

3、CK-2、Erk5、p-Erk5、Caspase-3、PI3K、p-P13K的表達情況。
　　 結(jié)果：
　　 1.缺氧1h、3h、6h、9h后,心肌細胞凋亡率分別為8.76±1.51％,15.36±2.34％,26.50±3.43％,41.96±4.22％,與對照組(2.6±0.34％)比較均有顯著性差異,(均P<0.01)；存活率分別為93.20±4.12％,86.14±3.10％,75.53±7.25％,60.21±

4、6.75％,與對照組(97.60±1.12％),比較均有顯著性差異,(均P<0.05)
　　 2.ROCK-1、ROCK-2缺氧1h即開始升高,3-6小時表達達高峰,9小時開始回落,且均明顯高于對照組(P<0.05)。
　　 3.Caspase-3在缺氧1小時開始逐漸升高,在隨后觀察的時相點內(nèi)持續(xù)處于高表達狀態(tài),與對照組比較均有顯著性差異(均P<0.01)。
　　 4.PI3K各時間點表達無明顯變化,而p-PI3

5、K在缺氧1h后開始升高,3小時達高峰,6小時開始回落,9h表達基本消失,各時間點比較差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　 5.Erk5缺氧1h即開始升高,3-6小時表達達高峰,9小時開始回落,且均明顯高于對照組(P<0.05)。
　　 6.Erk5阻斷劑處理后,心肌細胞凋亡率較單純?nèi)毖?h組明顯升高(P<0.01),存活率較單純?nèi)毖?h組明顯下降(P<0.01)；ROCK-1、ROCK-2較單純?nèi)毖?h組升高(P<0