未折疊蛋白反應(UPR)在缺氧心肌細胞中的相關(guān)探索.pdf

1、目的：本實驗通過建立缺氧心肌模型并測定未折疊蛋白反應相關(guān)物質(zhì)GRP78及XBP-1s mRNA相對含量的變化；進而評估未折疊蛋白反應（UPR）在心肌細胞不同缺氧時段的變化，最后揭示未折疊蛋白反應（UPR）在缺氧心肌細胞中的可能機理,可對如何減輕心肌缺氧損傷，及改善缺氧性心臟病的治療現(xiàn)狀提供實驗依據(jù)。
　　方法：本實驗主要分為三步：第一：從乳鼠心肌組織中提取心肌細胞并做心肌細胞鑒定；第二：將提取的心肌細胞移置三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，控制培

2、養(yǎng)箱中氧濃度為1％、二氧化碳濃度為5%，建立缺氧模型；第三：按要求培養(yǎng)細胞后收集細胞并提取目的基因RAN進行擴增；本實驗分為6組，分別記為H0、H6、H12、H24、H48、H72，實驗中將在正常氧濃度中培養(yǎng)24小時的心肌細胞取出，吸出培養(yǎng)基并用PBS液沖洗，吸凈后加入少量培養(yǎng)基，濾菌器過濾CO2及N2混合氣體，并以2L/min流量向培養(yǎng)瓶中通入，5min后移至三氣培養(yǎng)箱中，設定條件為1% O2、5% CO2，建立缺氧模型，分別培養(yǎng)0小

3、時、6小時、12小時、24小時、48小時、72小時后收獲心肌細胞；提取各組心肌細胞的總RNA，應用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（RT-PCR)檢測目的基因GRP78/Bip和 XBP-1s mRNA表達水平的變化，最后通過對組間相關(guān)數(shù)據(jù)的分析，評估未折疊蛋白反應（UPR）在缺氧不同時段的變化。
　　結(jié)果：本實驗以GAPDH為內(nèi)參基因，目的基因GRP78/Bip和 XBP-1s的光密度與GAPDH的光密度的比值記作目的基因的相對含量；實驗數(shù)據(jù)

4、應用SPSS16.0軟件進行單因素方差分析發(fā)現(xiàn)：GRP78/Bip mRNA H0與H6、H6與H24、H24與H72組之間均有顯著性差異（p<0.05），表明隨著缺氧時間的增加GRP78/Bip mRNA表達逐漸增高，直至72小時達到高峰；XBP-1s mRNA缺氧H6、H12、H24、H48組之間均有顯著性差異（p<0.05），從實驗結(jié)果可見 XBP-1s mRNA在缺氧6小時內(nèi)便有明顯的表達，12小時過后表達量逐漸下降，直至72小

5、時左右降至正常水平；
　　結(jié)論：1.XBP-1s可能是缺氧早期促進心肌細胞存活的重要激酶之一，但是其在心肌慢性缺氧適應中的作用較弱，這可能與GRP78/Bip的過表達抑制有關(guān)；
　　2.實驗結(jié)果顯示GRP78/Bip mRNA的表達隨著缺氧時間的增加逐漸增高，這可能與血小板反應素4的參與有關(guān)，與XBP-1s相比GRP78/Bip在持續(xù)性應激或劇烈應激中可能更有意義。
　　3. IRE通路在未折疊蛋白反應介導細胞調(diào)亡中可