熱休克蛋白90在缺氧心肌細(xì)胞中的表達(dá)及保護(hù)作用的研究.pdf

1、細(xì)胞缺氧是嚴(yán)重?zé)齻畛Ｒ?jiàn)的病理生理現(xiàn)象之一。以往的研究發(fā)現(xiàn)，嚴(yán)重?zé)齻皞笤缙趯?dǎo)致的組織細(xì)胞缺血缺氧、炎癥介質(zhì)釋放是導(dǎo)致早期“休克心”的兩大主要因素。如何減輕、遏止其介導(dǎo)的心肌損傷效應(yīng)是防治“休克心”的關(guān)鍵。近年來(lái)，如何調(diào)動(dòng)機(jī)體自身的抗損傷機(jī)制逐漸引起大家的注意。 嚴(yán)重?zé)齻皞笤缙趯?dǎo)致的組織細(xì)胞缺血缺氧、炎癥介質(zhì)釋放等因素作為嚴(yán)重的應(yīng)激必然會(huì)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的應(yīng)激反應(yīng)，而熱休克蛋白是生物體在不良環(huán)境因素作用下所產(chǎn)生的一組具有高

2、度保守性的應(yīng)激蛋白。熱休克蛋白90(heat shock protein 90，HSP90)是維持細(xì)胞內(nèi)蛋白構(gòu)象穩(wěn)定與功能正常所必需的分子伴侶，也是公認(rèn)的與應(yīng)激耐受密切相關(guān)的保護(hù)性分子。HSP90通過(guò)催化損傷和變性的蛋白質(zhì)再折疊，或者促進(jìn)損傷嚴(yán)重的蛋白質(zhì)解聚，從而保護(hù)細(xì)胞免受由應(yīng)激所導(dǎo)致的損傷。此外，HSP90還與體內(nèi)各種應(yīng)激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中多個(gè)關(guān)鍵分子相互作用，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)損害的耐受程度，提高細(xì)胞的生存率，在抗凋亡作用中扮演重要角色。

3、 我們推測(cè)，在缺氧條件下，心肌細(xì)胞中的HSP90會(huì)發(fā)生一定量的變化，從而影響其下游的效應(yīng)分子發(fā)揮作用。本研究旨在驗(yàn)證上述設(shè)想，明確缺氧條件下心肌細(xì)胞中HSP90的表達(dá)變化情況及分布，探討缺氧引起的HSP90變化是否對(duì)缺氧心肌細(xì)胞有保護(hù)作用，為臨床防治“休克心”提供新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 一、研究目的： 明確：HSP90在心肌細(xì)胞中隨缺氧時(shí)間變化的表達(dá)變化規(guī)律及分布情況，觀察其在早期心肌缺氧損害中的保護(hù)作用。 二

4、、材料方法 1、心肌細(xì)胞的培養(yǎng)及缺氧處理：胰酶消化法培養(yǎng)心肌細(xì)胞。為模擬燒傷后心肌缺氧環(huán)境，配制94％N<,2>、5％CO<,2>、1％O<,2>的混合氣體，作為心肌細(xì)胞的生長(zhǎng)環(huán)境，將心肌細(xì)胞放置于密閉缺氧罐中，通上述混合氣體，最終氧濃度為1％，進(jìn)行缺氧處理。 2、實(shí)驗(yàn)分組：將心肌細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組(常氧組、A組)、缺氧組(B組)、常氧+GA組(C組)、GA預(yù)處理后再缺氧組(缺氧+GA組、D組)。將B組、D組培養(yǎng)的細(xì)胞按

5、照缺氧時(shí)間分組標(biāo)記，分別選取1h、3h、6h、12h、24h時(shí)相點(diǎn)進(jìn)行觀察研究。 3、蛋白含量測(cè)定：免疫印跡法(Western Blot，WB)半定量HSP90蛋白含量變化。 4、分布形態(tài)研究：通過(guò)熒光顯微鏡應(yīng)用免疫熒光化學(xué)染色法進(jìn)行觀察。 5、用CCK-8試劑盒檢測(cè)各組心肌細(xì)胞的活力情況。 6、取培養(yǎng)心肌細(xì)胞上清液檢測(cè)各組LDH、CK-MB、肌鈣蛋白Ⅰ的含量變化。 三、主要結(jié)果 1、分析

6、WB結(jié)果得知，正常心肌細(xì)胞中HDP90含量較低，缺氧3h后HSP90蛋白表達(dá)量有所增加，增加趨勢(shì)一直持續(xù)到缺氧后12h達(dá)到峰值，缺氧24h后HSP90含量有所下降，與缺氧后1h接近。而用HSP90特異性阻斷劑GA后心肌細(xì)胞在缺氧后各個(gè)時(shí)相點(diǎn)的表達(dá)含量均明顯降低。 2、正常心肌細(xì)胞中HSP90呈顆粒狀分布在細(xì)胞胞漿中，分布不均，密度較低。隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞胞漿中HsP90的表達(dá)增加，表現(xiàn)為熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，且融合成片。通過(guò)圖象分

7、析量化胞漿中HSP90的免疫熒光強(qiáng)度變化發(fā)現(xiàn)，缺氧6h后HSP90蛋白的熒光強(qiáng)度值開(kāi)始增加，一直持續(xù)到缺氧后12h。 3、與正常對(duì)照組相比，單純?nèi)毖踅M6h后心肌細(xì)胞的活力下降，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，缺氧12h、24h活力下降顯著；與單純?nèi)毖踅M相比，GA+缺氧組在6h后心肌細(xì)胞的活力下降，缺氧12h、24h下降顯著。 4、與正常對(duì)照組相比，單純?nèi)毖踅M各個(gè)時(shí)相點(diǎn)中CK-MB含量有顯著升高；與單純?nèi)毖踅M相比，GA+缺氧組在各個(gè)時(shí)

8、相點(diǎn)中CK-MB含量有顯著升高。 5、與正常對(duì)照組相比，單純?nèi)毖鹾蟪毖?h外，其余各個(gè)時(shí)相點(diǎn)LDH含量有顯著升高；與單純?nèi)毖踅M相比，GA+缺氧組在各個(gè)時(shí)相點(diǎn)中LDH含量有顯著升高。 6、與正常對(duì)照組相比，單純?nèi)毖踅M在缺氧3、6、12h肌鈣蛋白Ⅰ含量有顯著升高；與單純?nèi)毖踅M相比，GA+缺氧組在缺氧1、3、6、12h肌鈣蛋白I含量有顯著升高。 四、全文結(jié)論 1、缺氧對(duì)心肌細(xì)胞中HSP90含量的變化有一定作用

9、。在缺氧早期12h之內(nèi)，HSP90含量的變化隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，有時(shí)間依賴性；到缺氧24h后HSP90含量有所下降。 2、缺氧導(dǎo)致HSP90的分布變化發(fā)生在細(xì)胞胞漿中，說(shuō)明其與下游分子的作用也發(fā)生在胞漿中。 3、運(yùn)用HSP90特異性阻斷劑GA阻斷HSP90表達(dá)后，心肌細(xì)胞活力在缺氧6、12、24h下降，反應(yīng)心肌細(xì)胞損傷的特異性的酶LDH、CK-MB在缺氧后各個(gè)時(shí)相點(diǎn)均顯著升高，肌鈣蛋白Ⅰ含量在缺氧1、3、6、1