TRAP1對缺氧心肌細胞的保護作用及機制研究.pdf

1、嚴重燒傷后,在毛細血管通透性增加導致有效循環(huán)血容量顯著減少之前,即可出現(xiàn)心肌缺血缺氧損害及心臟泵血功能減弱。這種傷后早期出現(xiàn)的心肌損害,不僅易引起心功能不全,還可誘發(fā)或加重休克,成為燒傷后早期機體缺血缺氧的重要啟動因素之一。研究表明缺氧不僅在燒傷早期心肌損害的發(fā)生過程中有著重要的作用,而且也參與了多種心臟疾病的病理生理過程。因此,研究缺氧條件下心肌細胞的損害機制對于闡明嚴重燒傷等疾病引起的心肌損害的發(fā)生機制有著重要的意義。線粒體是細胞能

2、量生成的主要場所,其也參與調控細胞的凋亡和壞死。在缺氧條件下,心肌細胞線粒體最易受到損傷,其結構破壞和功能紊亂直接導致了缺氧心肌細胞的死亡。研究發(fā)現(xiàn)缺氧等有害刺激可以引起線粒體基質腫脹,膜電位下降,外膜破裂,導致其通透性轉換孔(mitochondrial permeability transition pore,MPTP)開放增加,細胞色素c(cytochrome c,Cytc)等促凋亡物質釋放進入胞液,激活線粒體依賴的凋亡途徑,最終造

3、成細胞的死亡。MPTP大量開放導致的線粒體不可逆損傷是心肌細胞凋亡和壞死發(fā)生過程中的關鍵環(huán)節(jié)。MPTP是貫穿于線粒體內外膜由多種蛋白質組成的一個復合蛋白通道,其確切成分目前還存在著爭議,但越來越多的研究認為親環(huán)素D(cyclophilin D,CypD)是其中的一個重要調節(jié)蛋白。CypD被證實介導了多種因素引起的MPTP開放過程,抑制CypD的肽酰脯氨酰順反異構酶的活性能夠阻斷MPTP的開放。
　　 腫瘤壞死因子受體相關蛋白1(

4、tumor necrosis factor receptor-associated protein1,TRAP1)是一個分布在線粒體,屬于熱休克蛋白90(heat shock protein90,HSP90)家族,分子量約為75KDa的分子伴侶。與典型的HSP90家族相比,TRAP1有著相似的ATP酶活性,其酶活性能夠被HSP90特異性抑制劑格爾德霉素抑制,但其在調節(jié)線粒體功能方面又有著獨特的作用。既往研究表明,缺氧能夠誘導細胞HSP9

5、0表達增加,并且這種變化對細胞缺氧性損害起著保護作用,但缺氧后心肌細胞TRAP1的變化趨勢及作用目前還不清楚。TRAP1分布廣泛,在維持線粒體的自我穩(wěn)定狀態(tài)、調控腫瘤細胞凋亡和壞死的過程中起著重要的作用。由于MPTP的開放是細胞凋亡和壞死發(fā)生過程中的關鍵環(huán)節(jié),并且進一步研究證實TRAP1在腫瘤細胞中與MPTP的重要調節(jié)蛋白CypD存在著相互作用。因此我們推測:缺氧后心肌細胞TRAP1的變化能夠通過作用于CypD來影響MPTP的開放,從而

6、發(fā)揮細胞保護作用。本研究旨在對此假設進行驗證。
　　 一、研究目的:
　　 探討缺氧后心肌細胞TRAP1的表達對細胞缺氧性損害的保護作用及其調控機制。
　　 二、材料方法:
　　 1.原代培養(yǎng)SD大鼠乳鼠心肌細胞,建立細胞缺氧模型。
　　 2.應用免疫印跡及免疫熒光技術觀察常氧及不同缺氧時間處理后(缺氧1h,3h,6h和12h)心肌細胞TRAP1的表達變化。然后通過構建腺病毒載體轉染心肌細胞干預T

7、RAP1的表達,觀察其對缺氧心肌細胞(缺氧6h)的細胞活力和死亡的影響,從而明確缺氧后心肌細胞TRAP1表達的變化趨勢以及這種變化對細胞缺氧損害的作用。
　　 3.選用能反映MPTP開放的線粒體膜電位和細胞溶質中Cytc的含量作為檢測指標,分別觀察干預TRAP1后缺氧心肌細胞這兩個指標以及caspase3活性的改變,明確TRAP1能夠調節(jié)缺氧心肌細胞MPTP的開放,并進而影響線粒體依賴的凋亡途徑。在此基礎上運用MPTP特異性阻斷

8、劑CsA阻斷MPTP開放,探討其能否阻止下調TRAP1表達對缺氧心肌caspase3活性、細胞活力和死亡的作用,以此來闡明TRAP1通過減少MPTP開放,調節(jié)線粒體依賴的凋亡途徑,從而發(fā)揮對缺氧心肌細胞的保護作用。
　　 4.運用免疫共沉淀和蛋白質譜分析技術明確TRAP1與CypD是否存在相互作用,同時檢測干預TRAP1的表達對心肌細胞CypD蛋白和基因表達的影響。此外觀察單純缺氧以及MPTP開放抑制劑CsA對CypD蛋白和基因

9、表達的影響,從而明確TRAP1可能是通過作用于CypD來調節(jié)MPTP開放。
　　 三、主要結果
　　 1.心肌細胞缺氧處理1h后,TRAP1的表達較常氧狀態(tài)下即增加,并且隨著缺氧時間的延長,TRAP1增加越明顯,至缺氧后12h,TRAP1的表達與常氧組相比仍顯著增多。
　　 2.缺氧6h后,過表達TRAP1減輕了缺氧導致的心肌細胞活力降低和死亡增加,而下調TRAP1表達則加重了缺氧引起的上述細胞損傷。
　　

10、 3.缺氧6h后,過表達TRAP1減輕了缺氧導致的線粒體膜電位下降、細胞溶質中Cytc含量及胞漿中caspase3活性增加,而下調TRAP1表達則加重了缺氧引起的上述損傷。使用MPTP開放特異性阻斷劑CsA能夠阻斷下調TRAP1表達引起的缺氧心肌細胞活力下降、細胞死亡和caspase3活性增加。
　　 4.常氧及缺氧條件下,心肌細胞中TRAP1和CypD均不存在著相互作用。過表達TRAP1能夠使常氧心肌細胞CypD mRNA的

11、表達增加,而下調TRAP1表達則降低了CypD mRNA的表達水平,但干預TRAP1表達對CypD蛋白含量沒有明顯作用。缺氧6h后,心肌細胞CypD mRNA的表達量較常氧組顯著降低,而CsA在常氧和缺氧條件下均能增加CypD mRNA的表達量。同樣缺氧及CsA處理后,心肌細胞CypD蛋白表達水平?jīng)]有明顯改變。
　　 四、結論
　　 1.缺氧能夠誘導心肌細胞TRAP1表達增多,并且隨著缺氧時間的延長,TRAP1的增多越明