G-CSF對心肌細(xì)胞保護(hù)作用機(jī)制的研究.pdf

1、粒系集落刺激因子(granulocytecolony-stimulatingfactor,G-CSF)在調(diào)節(jié)髓細(xì)胞增生、分化、生存中起著非常重要的作用,可以動(dòng)員骨髓干細(xì)胞由骨髓釋放入外周血?；谶@一機(jī)制,Orlic提出了細(xì)胞因子動(dòng)員骨髓干細(xì)胞歸巢至缺血損傷部位修復(fù)梗死心臟的設(shè)想1,隨后在成鼠心肌梗死前后注射重組人G-CSF等細(xì)胞因子治療,治療組心功能和生存率均有明顯改善2-8。其后的基礎(chǔ)研究結(jié)果證明,除了可以動(dòng)員骨髓干細(xì)胞以外,由于心肌

2、細(xì)胞表面有G-CSF受體表達(dá),G-CSF還可以通過活化心肌細(xì)胞的G-CSF受體直接作用于心肌細(xì)胞本身,激活相關(guān)的蛋白激酶Jak2-STAT3和Akt-eNOS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,從而抑制心肌細(xì)胞凋亡,這說明了G-CSF對心肌細(xì)胞具有直接保護(hù)作用即抗凋亡效應(yīng)7-8。
　　 目前對于G-CSF的研究多集中于心肌梗死后梗死心肌的再生和保護(hù)方面,而G-CSF對于非梗死心肌的作用如何?對于冠心病常常伴有的高血壓、心力衰竭中的心肌細(xì)胞是否有益?其

3、作用的機(jī)制到底怎樣?已經(jīng)有研究證明G-CSF干預(yù)可以改善心肌梗死后小鼠的心功能,但與心肌再生無明顯相關(guān)。同樣,在最近的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)G-CSF在壓力超負(fù)荷所至的心肌肥厚模型中能夠加重心肌肥厚的形成,提示了G-CSF可能對心肌細(xì)胞還有抗凋亡以外的作用。
　　 心力衰竭是各種心血管疾病包括高血壓、冠心病等的終末階段。心力衰竭不僅僅是心肌細(xì)胞和血管完整性的病理變化同時(shí)也是一系列神經(jīng)體液因素的激活參與的過程,其中交感神經(jīng)和腎素血管緊

4、張素系統(tǒng)最為重要。無論是心力衰竭還是高血壓都伴隨心肌細(xì)胞代償性的增大,造成心肌肥厚,心室重構(gòu)。左室心肌肥厚是引起心血管疾病發(fā)生率與死亡率升高的因素之一。研究發(fā)現(xiàn),絲裂素活化蛋白激酶家族(Mitogenactivatedproteinkinases,MAPKs)參與心肌細(xì)胞的增殖,分化和凋亡過程,其中研究重點(diǎn)在ERK通路,ERK是把細(xì)胞外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)到核內(nèi)調(diào)控基因表達(dá)的重要細(xì)胞內(nèi)信號分子,是不同促增殖因子調(diào)控的共同通路。
　　 由此,

5、我們設(shè)計(jì)了驗(yàn)證G-CSF是否能夠直接促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大的細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn),觀察了G-CSF刺激下心肌細(xì)胞的肥大反應(yīng),我們選擇了與細(xì)胞增生相關(guān)的ERK磷酸化作為評價(jià)指標(biāo);同時(shí),由于心肌細(xì)胞內(nèi)的血管緊張素系統(tǒng)參與了心肌細(xì)胞肥大的形成過程,我們又以細(xì)胞內(nèi)血管緊張素原(AGT)和血管緊張素受體作為切入點(diǎn),分別選用了血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)和血管緊張素Ⅱ受體阻斷劑(ARB)進(jìn)行干預(yù),著重研究了G-CSF在細(xì)胞水平促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大的可能機(jī)制。

6、
　　 第一部分G-CSF促進(jìn)壓力超負(fù)荷引起的心肌肥厚作用
　　 目的:觀察G-CSF對壓力超負(fù)荷心肌肥厚動(dòng)物模型心肌肥厚形成的影響
　　 方法:選10周齡雄性C57/BL6小鼠,通過縮窄升主動(dòng)脈建立壓力超負(fù)荷模型。造模成功后平均分成4組(每組6只),分別為生理鹽水組(每天1次皮下注射生理鹽水到實(shí)驗(yàn)結(jié)束)、G-CSF組(每天1次皮下注射G-CSF<5μg/kg/d>,連續(xù)注射5天后改為每天1次皮下注射生理鹽水到實(shí)

7、驗(yàn)結(jié)束)、ARB+G-CSF組(每天1次皮下注射ARB<10-7M>到實(shí)驗(yàn)結(jié)束;同時(shí)每天1次皮下注射G-CSF<5μg/kg/d>連續(xù)5天)、ARB組(每天1次皮下注射ARB<10-7M>到實(shí)驗(yàn)結(jié)束)。另外設(shè)偽手術(shù)組作為對照。2W后做心臟超聲檢查,測量左室厚度,并測右頸動(dòng)脈血壓。
　　 結(jié)果:1)壓力超負(fù)荷2周后,生理鹽水組與對照組比較,左室厚度明顯增加(P＜0.05);G-CSF皮下注射組與生理鹽水組比較,左室厚度進(jìn)一步增加(

8、P＜0.05),提示G-CSF加重壓力超負(fù)荷引起的心肌肥厚;
　　 2)壓力超負(fù)荷后ARB組與生理鹽水組比較,2周后左室厚度明顯減低(P＜0.05),ARB+G-CSF組與G-CSF組比較,2周后左室厚度也明顯減低(P＜0.05),提示ARB不但能減輕壓力超負(fù)荷引起的心肌肥厚,也能部分抑制G-CSF導(dǎo)致的心肌肥厚。
　　 結(jié)論:G-CSF能夠加重壓力超負(fù)荷引起的心肌肥厚,其機(jī)制可能與激活血管緊張素有關(guān)。
　　 第

9、二部分G-CSF引起心肌細(xì)胞肥大反應(yīng)的機(jī)制研究
　　 目的:研究離體狀態(tài)下G-CSF誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大反應(yīng)以及相關(guān)的機(jī)制。
　　 方法:
　　 1)細(xì)胞免疫熒光:SD乳鼠原代心肌細(xì)胞經(jīng)10％FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24h后更換為0.2％FBS的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48h。實(shí)驗(yàn)設(shè)2個(gè)大組:對照組和G-CSF干預(yù)組,分別加生理鹽水和G-CSF(終濃度為100ng/ml)培養(yǎng)48h。細(xì)胞固定后孵育兩種抗體:抗Act

10、inin和抗ERK抗體;分別用FITC和Rhodamine熒光抗體標(biāo)記后熒光顯微鏡拍照。觀察心肌細(xì)胞肥大反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
　　 2)Westernblot法檢測ERK活性:SD乳鼠原代心肌細(xì)胞經(jīng)10％FBS的OMEM培養(yǎng)液靜置培養(yǎng)24小時(shí)后更換低血清(0.2％)DMEM繼續(xù)培養(yǎng)24h,加入干預(yù)因素,首先觀察G-CSF作用的時(shí)間曲線,實(shí)驗(yàn)分5組:A.0min組B.5min組C.10min組D.15min組E.30min組。其次

11、加入ARB和ACEI前處理后再加G-CSF,實(shí)驗(yàn)分4組:A.空白對照組。B.G-CSF組。C.ARB+G-CSF組D.ACEI+G-CSF組。G-CSF終濃度為100ng/ml。用westernblot法測定磷酸化ERK表達(dá)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
　　 3)RT-PCR法檢測AGT表達(dá):SD乳鼠原代心肌細(xì)胞經(jīng)10％FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24h后,更換為低血清(0.2％)DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí).實(shí)驗(yàn)設(shè)4組,按照G-CSF作用

12、時(shí)間不同分為:對照組,2h組,6h組,12h組。每組分別加入G-CSF使G-CSF終濃度為100ng/ml。以RT-PCR方法檢測AGT水平變化。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
　　 結(jié)果:1)G-CSF作用心肌細(xì)胞后能夠?qū)е滦募〖?xì)胞肥大,并引起ERK向細(xì)胞核周圍聚集。
　　 2)G-CSF引起心肌細(xì)胞內(nèi)磷酸化ERK表達(dá)增多,呈時(shí)間依賴性,30min達(dá)到最高。
　　 3)ACEI部分降低G-CSF對ERK的磷酸化水平(P＜0.0