谷氨酰胺誘導(dǎo)心肌細(xì)胞熱休克蛋白表達(dá)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究.pdf

1、目的：本文研究谷氨酰胺（Gln）誘導(dǎo)熱休克蛋白70（HSPT0）表達(dá)對脂多糖（LPS）刺激乳鼠心肌細(xì)胞的保護(hù)作用及0位-N-乙酰葡萄糖胺（O-GlcNAc）修飾在Gln誘導(dǎo)HSP70表達(dá)機(jī)制中的作用。 方法：原代培養(yǎng)SD乳鼠心肌細(xì)胞，實驗分六組：對照組（control，C組）給予雙蒸水；Gln組給予Gln5mM；LPS組給予4μg/ml內(nèi)毒素（LPS）；Gln+LPS組給予Gln5mM+LPS4μg/ml；GLA組給予Gln5m

2、M+LPS4μg/ml+Alloxan1mM（Alloxan，四氧嘧啶，為0位-N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶OGT抑制劑，能阻止OGT催化N-乙酰氨基葡萄糖胺（GlcNAc）與蛋白質(zhì)絲氨酸、蘇氨酸側(cè)鏈羥基連接，減少O-GlcNhc修飾水平）；GLP組給予Gln5mM+LPS4μg/ml+PUGNAc100μM（PUGNAc，朋那克，為0位-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶OGA抑制劑，能阻止OGA將GlcNAc從蛋向質(zhì)側(cè)鏈羥基上移除，增加O-GlcN

3、Ac修飾水平）。干預(yù)后6h，以臺盼藍(lán)拒染法測定細(xì)胞生存率；比色法測定細(xì)胞培養(yǎng)液LDH活力以反映心肌細(xì)胞損傷情況；Western Blotting分析心肌細(xì)胞HSP70蛋白水平、胞核熱休克因子-1（HSF-1）蛋白水平和O-GlcNAc修飾水平；電泳遷徙率變動實驗（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）測定心肌細(xì)胞核HSF-1轉(zhuǎn)錄活性。計量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間數(shù)據(jù)采用單因素方

4、差分析，以P<0．05有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果：干預(yù)后6h各組細(xì)胞生存率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0．05）。與C組相比，給予LPS后細(xì)胞損傷增加（P<0．05），同時給予Gln和LPS能減輕心肌細(xì)胞損傷（P<0．05），此保護(hù)作用與HSP70的含量有關(guān)。Gln能增加LPS刺激心肌細(xì)胞HSPT0蛋白水平、胞核HSF-1蛋白水平及轉(zhuǎn)錄活性（P<0．05）。給予Gln后能增加LPS刺激心肌細(xì)胞O-GlcNAc修飾水平（P<0．05），此時心

5、肌細(xì)胞O-GlcNAc修飾水平與HSP70蛋白水平變化趨勢一致。為了進(jìn)一步證實O-GlcNAc修飾與HSP70的關(guān)系，實驗使用Alloxan和PUGNAc對心肌細(xì)胞O-GlcNAc修飾水平進(jìn)行干預(yù)，在此基礎(chǔ)上觀察HSP70蛋白水平、胞核HSF-1蛋白水平及轉(zhuǎn)錄活性變化情況。給予Alloxan能減少心肌細(xì)胞O-GlcNAc修飾水平，減少胞核HSF-1蛋白水平及轉(zhuǎn)錄活性，減少HSP70蛋白水平，增加心肌細(xì)胞損傷（P<0．05）；給予PUGN

6、Ac能增加心肌細(xì)胞O-GlcNAc修飾水平，增加胞核HSF-1蛋白水平及轉(zhuǎn)錄活性，增加HSP70蛋白水平（P<0．05）。 結(jié)論：LPS刺激乳鼠心肌細(xì)胞HSP70蛋白水平與胞核HSF-1蛋白水平及轉(zhuǎn)錄活性相關(guān)。O-GlcNAc修飾能作為感受器感知細(xì)胞外界環(huán)境變化并調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子HSF-1的水平及轉(zhuǎn)錄活性。LPS刺激乳鼠心肌細(xì)胞給予Gln治療，可通過增加O-GlcNAc修飾水平，增加核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子HSF-1水平及轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而促進(jìn)HS