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文檔簡介
1、目的:研究谷氨酰胺(glutamine,Gln)饑餓對細胞生長及活力的影響,探討Akt-YAP(proteinkinaseB-Yes-associatedprotein)信號通路在Gln調(diào)節(jié)細胞凋亡過程中的作用機制。
方法:以體外培養(yǎng)的Hela細胞作為實驗對象。首先用不同濃度胎牛血清(fetalbovineserum,FBS)和Gln(10%FBS+4mMGln、10%FBS+Gln-Free、FBS-Free+4mMGln、
2、FBS-Free+Gln-Free)分別培養(yǎng)Hela細胞24h和48h,細胞計數(shù)法檢測細胞的增殖情況;不同濃度Gln(4、2、1、0.5、0.1、0mM)培養(yǎng)Hela細胞24h,CCK-8檢測細胞活性,Westernblot檢測Bax蛋白的表達;
不同濃度Gln(4、2、1、0.5、0.1、0mM)或Gln4mM、Gln0mM和Akt抑制劑LY29400240μM+Gln4mM分別培養(yǎng)Hela細胞24h,Westernblot
3、檢測pAkt和Bax蛋白的表達;
不同濃度Gln(4、2、1、0.5、0.1、0mM)培養(yǎng)Hela細胞24h,Westernblot檢測pYAP和YAP蛋白的表達;利用siRNA干擾Hela細胞YAP蛋白的表達,Gln4mM或0mM分別培養(yǎng)正常細胞或轉(zhuǎn)染后的細胞24h,Westernblot檢測Bax蛋白的表達;分別用Gln4mM、Gln0mM和Akt抑制劑LY29400240μM+Gln4mM培養(yǎng)細胞24h,Westernb
4、lot檢測pYAP蛋白及胞漿和胞核YAP蛋白的表達。
結(jié)果:不論是否添加FBS,不含Gln的培養(yǎng)基細胞生長速度緩慢,細胞數(shù)量顯著降低(P<0.05);低濃度Gln(0.5、0.1、0mM)組細胞活性明顯下降(P<0.05),Bax表達增加;
隨著Gln濃度的降低pAkt表達降低,Gln饑餓和Akt抑制劑均增加了Bax蛋白的表達;
隨著Gln濃度的降低pYAP表達降低,利用siRNA干擾YAP蛋白的表達降低了
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