MED抑制Ssp90誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡的信號通路分析.pdf

1、熱休克蛋白90(Heat shock protein90，Hsp90)是公認(rèn)的抗腫瘤藥物的分子靶點(diǎn)。與其它分子靶點(diǎn)不同，它在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，并在調(diào)控細(xì)胞增殖、分化以及凋亡相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮重要作用。其抑制劑格爾德霉素(geldanamycin，GA)的衍生物17-AAG，IPI-504等作為抗腫瘤藥物已進(jìn)入臨床研究。不僅如此，由于其具有單一靶點(diǎn)的多效抗腫瘤機(jī)制，因而Hsp90抑制劑不僅是分子靶向抗腫瘤藥物的重要來源，而且也使其成

2、為重要的小分子探針。
　　 前期在篩選Hsp90抑制劑時，發(fā)現(xiàn)海洋真菌Diaporthe phaseolorum HLY2產(chǎn)生的小分子化合物真菌環(huán)氧二烯(mycoepoxydiene，MED)對Hsp90具有一定的抑制活性。因而本文對MED抑制Hsp90誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡的信號通路進(jìn)行分析，以期明確其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，夯實(shí)其基礎(chǔ)研究。為從海洋微生物中尋找靶向抗腫瘤先導(dǎo)化合物，豐富Hsp90抑制劑的作用機(jī)制提供重要依據(jù)

3、。
　　 通過分子對接預(yù)測MED與Hsp90結(jié)合能量和結(jié)合位點(diǎn)的基礎(chǔ)上，采用熒光、Biacore等方法，研究Hsp90與MED的相互作用、分析其結(jié)合常數(shù)；利用變性熒光素酶的再復(fù)性實(shí)驗(yàn)，研究MED抑制Hsp90的分子伴侶活性。在用MTT法分析MED的腫瘤細(xì)胞毒活性的基礎(chǔ)上，通過Western Blotting、 Co-IP和免疫熒光染色、熒光共定位以及RNA干擾等技術(shù)方法，研究MED對客戶蛋白的降解作用及其對相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)水平的影

4、響。通過以上研究得到以下結(jié)果：
　　 1)MED與Hsp90存在結(jié)合作用，其結(jié)合常數(shù)約為104 L/mol(相同實(shí)驗(yàn)條件GA的結(jié)合常數(shù)約為105 L/mol)。
　　 2)MED對Hsp90的分子伴侶活性具有抑制作用，其抑制活性高于對ATPase活性的抑制作用；MED作用于HeLa細(xì)胞1h即可使Hsp90與客戶蛋白分離，降低Akt、IKK、Raf-1、AhR以及HER2等客戶蛋白的表達(dá)水平。
　　 3)MED對與

5、客戶蛋白相關(guān)的細(xì)胞存活及凋亡相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路具有抑制和激活作用。具體表現(xiàn)在MED抑制IKK/IκBα/NF-κB增殖信號通路，激活因Akt下調(diào)，Bad釋放引起的凋亡通路、以及由Raf-1相關(guān)的MER/ERK信號通路的持續(xù)激活，伴隨p21升高引起的細(xì)胞周期阻滯，從而引起細(xì)胞凋亡。
　　 4)MED下調(diào)AMPK的表達(dá)水平，Hsp90與AMPK具有較強(qiáng)的結(jié)合作用，且MED可以引起Hsp90-AMPK復(fù)合體的分離。Hsp90表達(dá)水平降

6、低后，亦可降低AMPK的表達(dá)，進(jìn)而抑制AMPK信號通路的激活。AMPK表現(xiàn)出Hsp90客戶蛋白的特征。
　　 5)MED對宮頸癌細(xì)胞株HeLa、胃癌細(xì)胞株BGC-823、結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-116和乳腺癌細(xì)胞株，均表現(xiàn)出一定的細(xì)胞毒活性，且可以誘導(dǎo)HeLa等腫瘤細(xì)胞形態(tài)發(fā)生凋亡狀改變。此外，活性氧ROS在MED抑制Hsp90誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡中具有協(xié)同促進(jìn)作用。
　　 根據(jù)上述結(jié)果得到以下研究結(jié)論(1)MED是Hsp9

7、0抑制劑，通過抑制Hsp90引起相關(guān)客戶蛋白的降解，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖信號通路的抑制，相應(yīng)地開啟凋亡信號通路，而發(fā)揮其抗腫瘤作用。(2)MED是TNF-α/NF-κB信號通路的阻斷劑，可以抑制NF-κB的入核。(3)MED是小分子探針，通過MED的作用，發(fā)現(xiàn)了已知蛋白質(zhì)中的Hsp90的新客戶蛋白——AMPK。MED可以抑制AMPK及其下游蛋白質(zhì)ACC的激活。(4)活性氧ROS協(xié)同MED抑制Hsp90，誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡。