DAM的發(fā)酵放大及其誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡機(jī)制的初步研究.pdf

1、豐富的海洋生物資源為天然產(chǎn)物提供了重要來源，紅樹內(nèi)生真菌由于獨(dú)特的生理和代謝系統(tǒng)，產(chǎn)生了一些新穎獨(dú)特的次級(jí)代謝產(chǎn)物。去乙酰真菌環(huán)氧二烯（Deacetylmycoepoxydiene，DAM）是本課題組楊麗珊同學(xué)從紅樹植物秋茄內(nèi)生擬莖點(diǎn)霉屬真菌A-1-2-3次級(jí)代謝產(chǎn)物中分離得到，具有新穎的含氧橋結(jié)構(gòu)骨架，前期實(shí)驗(yàn)表明，該化合物具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性。
　　本論文通過對(duì)菌株發(fā)酵技術(shù)參數(shù)的優(yōu)化，確立了DAM液體發(fā)酵放大的工藝控制流程并進(jìn)

2、行了規(guī)模制備，初步闡明了DAM的抗腫瘤作用及其誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，并通過裸鼠移植瘤模型驗(yàn)證其體內(nèi)抗腫瘤作用。主要研究結(jié)果包括以下幾個(gè)方面:
　　1)在10L罐水平篩選確定P2-139菌株作為后續(xù)發(fā)酵菌株，并對(duì)P2-139發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)中的葡萄糖濃度和馬鈴薯汁濃度、接種量及發(fā)酵轉(zhuǎn)速進(jìn)行調(diào)整優(yōu)化，最終確定P2-139的發(fā)酵培養(yǎng)基組成:馬鈴薯200g/L、葡萄糖65g/L、陳海水20％（V/V）;接種量為5-7％之間;10L罐

3、轉(zhuǎn)速控制在400r/min以內(nèi)，200L罐300r/mim以內(nèi)。
　　2)10L罐水平上，以發(fā)酵不同階段的臨界氧濃度和KLa為依據(jù)，并考慮生物量的影響，我們提出了通過對(duì)轉(zhuǎn)速和通氣量的調(diào)節(jié)，使DO在發(fā)酵前期維持在20％～30％，發(fā)酵中期在28％以上，發(fā)酵后期在30％～60％的分階段溶氧控制發(fā)酵工藝，并取得了良好的效果，DAM產(chǎn)量穩(wěn)定可達(dá)100mg/L以上。
　　3)通過對(duì)發(fā)酵過程殘?zhí)菨舛鹊臏y(cè)定，結(jié)合DAM產(chǎn)生特點(diǎn)，提出發(fā)酵后期

4、流加補(bǔ)料策略，對(duì)比了不同的補(bǔ)料形式與濃度，最終確定葡萄糖+馬鈴薯汁復(fù)合補(bǔ)料流加的方式，并將殘?zhí)菨舛瓤刂圃?0g/L的方案。
　　4)利用上述優(yōu)化后的發(fā)酵條件，以DO控制為準(zhǔn)則在200L罐上進(jìn)行中試放大，DAM產(chǎn)量達(dá)到123.1mg/L，發(fā)酵數(shù)次，并規(guī)模制備，共制備20g以上的DAM。
　　5)通過MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，DAM可有效抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，其中HeLa細(xì)胞對(duì)DAM作用最敏感。
　　6) DAM可誘導(dǎo)HeLa

5、細(xì)胞出現(xiàn)caspase依賴性的凋亡，凋亡過程出現(xiàn)Bax向線粒體聚集，Cyto C從線粒體釋放，抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL表達(dá)量下降，而促凋亡蛋白Bax等上調(diào)。DAM可誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞出現(xiàn)G2/M期周期阻滯，多個(gè)與周期相關(guān)蛋白含量出現(xiàn)變化，p21、CyclinB1、GADD45α上調(diào)，Cdc25c、Wee1等下降。
　　7) DAM誘導(dǎo)的HeLa細(xì)胞凋亡與ROS含量的上升相關(guān)， DAM可引起Trx-ASK1復(fù)合物的分離，并進(jìn)

6、而激活相關(guān)信號(hào)通路。DAM可抑制HeLa細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞存活相關(guān)的多個(gè)Hsp90客戶蛋白的表達(dá)，并可持續(xù)性激活MEK/ERK信號(hào)通路。
　　8)通過HeLa細(xì)胞裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，DAM能有效抑制移植瘤的生長(zhǎng)，抑制率達(dá)64.8％，通過對(duì)移植瘤的免疫組化分析，發(fā)現(xiàn)DAM可引起移植瘤內(nèi)多種Hsp90相關(guān)蛋白改變，AKT蛋白表達(dá)量在給藥組明顯下降，MEK和ERK的磷酸化水平明顯上升。
　　以上研究結(jié)果為具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的DAM的工業(yè)化