復(fù)合海藻多糖及其誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡機理研究.pdf

1、海藻多糖具有多種生理活性，如抗腫瘤、抗氧化、機體免疫調(diào)節(jié)等，且毒副作用小，已成為海洋天然產(chǎn)物研究的熱點之一。研究發(fā)現(xiàn)復(fù)合多糖藥理作用呈現(xiàn)協(xié)同性，目前食用菌和中草藥復(fù)合多糖研究報道較多，其中食用菌類復(fù)合多糖作為廣譜的免疫促進劑和腫瘤輔助治療藥物已得到廣泛的應(yīng)用，然而對于復(fù)合海藻多糖的研究鮮有報道。因此，本文選取三種資源豐富的海藻：壇紫菜（Porphyra haitanensis）、螺旋藻（Spirulina platensis）、海帶（L

2、aminaria japonica），分別采用雙水相萃取分離新技術(shù)和木瓜蛋白酶法代替?zhèn)鹘y(tǒng)的乙醇沉淀和TCA、Sevage除蛋白等方法制備高活性紫菜、螺旋藻多糖和海帶多糖，進而研究復(fù)合海藻多糖及其對腫瘤HeLa細(xì)胞生長抑制的增效作用和作用機制。
　　研究結(jié)果如下：
　　(1)乙醇-硫酸銨雙水相萃取紫菜多糖體系優(yōu)化
　　采用濁點滴定法繪制乙醇-硫酸銨雙水相相圖，根據(jù)相圖選取5個不同系線長度（TLL）的體系進行優(yōu)化，以多糖回

3、收率為主要指標(biāo)同時考察蛋白的分配情況，得最優(yōu)體系為：TLL=40（乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)27％、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)18%），此時，多糖回收率Y達79.8%，分配系數(shù)K為0.23。
　　(2)海藻多糖制備及結(jié)構(gòu)初步分析
　　采用不同的乙醇-硫酸銨雙水相優(yōu)化體系分別萃取紫菜、螺旋藻多糖，待分相后取下相，置于4℃冰箱結(jié)晶除去大部分硫酸銨，上清經(jīng)透析得透析液；通過水提、脫膠、除褐藻酸、乙醇沉淀制備海帶粗多糖，采用木瓜蛋白酶法除蛋白，醇沉水溶后經(jīng)透

4、析得透析液；各多糖透析液分別經(jīng)濃縮、真空冷凍干燥得三種海藻多糖樣品，其多糖含量均達90%以上。紅外光譜分析表明三種樣品均為多糖類物質(zhì)，其中紫菜、海帶多糖含有硫酸基，而螺旋藻多糖未見有硫酸基特征吸收峰，其為α-糖苷鍵連接。1H-NMR分析表明紫菜多糖含有α、β型異頭碳，而螺旋藻、海帶多糖異頭碳為β構(gòu)型。
　　(3)復(fù)合海藻多糖配比優(yōu)化及其對HeLa細(xì)胞的作用
　　采用SRB法分別檢測紫菜多糖（PPH）、螺旋藻多糖（PSP）、海

5、帶多糖（PLJ）及其不同配比構(gòu)成的復(fù)合多糖對HeLa細(xì)胞生長抑制情況，通過正交實驗篩選出三種多糖最適配比PPH：PSP：PLJ為3：5：7，由此配比組合成復(fù)合海藻多糖（APC）。實驗表明，APC對HeLa細(xì)胞生長具有明顯的抑制作用，且呈劑量依賴性，IC50值為374.45μg/mL；當(dāng)濃度為600μg/mL，作用48h后，對HeLa細(xì)胞生長抑制率高達69.70%，明顯高于三種單味多糖中的最高抑制率（52.76%）。通過細(xì)胞形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)A

6、PC能顯著抑制HeLa細(xì)胞生長，使細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的凋亡特征，隨著劑量和處理時間的增加，凋亡或壞死的細(xì)胞數(shù)目增多；Annexin-V/PI雙染色法分析證實APC能誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡或壞死，且具有劑量依賴關(guān)系。
　　(4) APC誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡途徑探究
　　JC-1染色分析表明APC處理組HeLa細(xì)胞線粒體膜電位顯著降低，且呈劑量依賴性。不同劑量的APC處理HeLa細(xì)胞48h后，細(xì)胞Caspase-9、Caspase-3酶

7、活力均增強，與對照相比，差異極顯著（P<0.01）。APC可降低HeLa細(xì)胞線粒體膜電位，提高Caspase-9、Caspase-3酶活力，誘導(dǎo)其凋亡或壞死，推測其抗腫瘤作用可能與線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān)。
　　結(jié)果表明：三種海藻多糖復(fù)合，對 HeLa細(xì)胞抑制作用明顯增強，顯示出較強的抗腫瘤活性；APC可通過線粒體介導(dǎo)的途徑誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡或壞死。本研究結(jié)果可為海藻多糖抗腫瘤功能食品或藥物的進一步研究提供可靠的實驗基礎(chǔ)和依據(jù)，