天花粉蛋白抑制HeLa細胞生長及誘導細胞凋亡機制研究.pdf

1、天花粉作為一種傳統(tǒng)的中草藥，在我國入藥歷史悠久，主要應用于引產(chǎn)。上世紀80年代，天花粉蛋白(Trichosanthin，TCS)被證實為藥物的有效成分。天花粉蛋白，是一種單鏈的核糖體失活蛋白，含247個氨基酸殘基，通過N-糖苷酶活性使真核細胞的核糖體失活。一直以來，天花粉蛋白在臨床上主要應用于中期引流和治療異位妊娠、胎盤殘留以及滋養(yǎng)層細胞腫瘤。近年來，研究發(fā)現(xiàn)，天花粉蛋白具有多種藥理學活性，包括免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤和抗HIV。為此，天花粉蛋

2、白已受到廣泛的關注。 本研究將特別關注天花粉蛋白的抗腫瘤活性及其機制。天花粉蛋白對多種腫瘤有抗癌活性，如絨毛膜細胞癌、肝細胞癌，以及其他消化道腫瘤等。最初的研究發(fā)現(xiàn)，天花粉蛋白對絨毛癌JAR細胞的損傷作用，在于其對細胞核糖體有特異的損傷作用。隨后又發(fā)現(xiàn)天花粉蛋白可以通過誘導JAR細胞凋亡而發(fā)揮其抗癌作用。由此可見，天花粉蛋白目前的抗癌作用研究主要集中在絨毛膜細胞癌和消化道腫瘤上，而有關它對其它腫瘤細胞作用的研究報導尚不多見。而且

3、有關天花粉蛋白的抗癌機制尚不確定。為此，我們選擇了HeLa細胞(人宮頸癌細胞)為研究對象，觀察天花粉蛋白對其生長的抑制作用，并且從細胞凋亡和細胞周期兩個方面來研究天花粉蛋白抑制HeLa細胞生長的機制，并進一步探討天花粉蛋白誘導細胞凋亡的機理。 細胞的增值、凋亡、分化和衰老均是細胞周期依賴性的，所以，從天然藥物中，特別是中草藥，篩選能夠調(diào)節(jié)細胞周期，并且引起細胞凋亡，從而抑制細胞生長的藥物，將是今后抗腫瘤治療最理想的途徑。本實驗在

4、藥物對細胞生長作用研究的基礎上，首次研究了天花粉蛋白對HeLa細胞誘導凋亡和細胞周期阻滯的作用，并進一步探討其誘導凋亡的機制，為天花粉蛋白在腫瘤防治中的應用提供重要的實驗依據(jù)，同時為天花粉蛋白的抗癌機制提供新的研究途徑。 研究目的 研究天花粉蛋白對人宮頸癌HeLa細胞的生長抑制作用，從細胞凋亡和細胞周期兩個方面來考察細胞生長抑制的機制，并進一步探討天花粉蛋白誘導HeLa細胞發(fā)生凋亡的分子機制。 研究方法 采用CCK-

5、8的方法，檢測TCS對HeLa細胞的抑制作用；流式細胞儀檢測TCS對細胞周期的影響；電子顯微鏡和Annexin法觀察TCS對HeLa細胞誘導凋亡的作用；應用Westernblot和RT-PCR法觀察HeLa細胞Caspase-3酶原和mRNA的表達變化；用Caspases活性檢測試劑盒，檢測Caspase-3，8，9的活性。 研究結果 (1)TCS對HeLa細胞的生長具有明顯的抑制作用。隨著時間的延長、濃度的增加，抑制作用明顯

6、加強，呈顯著的時間和濃度依賴性。HeLa細胞經(jīng)TCS100μg/ml作用24h，細胞生長抑制率為31.6±3.92％，而作用48h，細胞殺傷率達49.34±4.49％。此外，隨著作用時間的延長，TCS對HeLa細胞的半數(shù)抑制濃度明顯下降，其中TCS作用36h，IC50是191.46μg/ml；TCS作用48h，IC50為101.34μg/ml。(2)流式細胞術分析顯示，同一濃度(100μg/ml)TCS作用HeLa細胞24、36和48h

7、，隨著TCS作用時間的延長，S期細胞比例也隨之增高，G2/M期細胞所占比例相應減少；不同濃度的TCS作用HeLa細胞48h，發(fā)現(xiàn)50、100μg/mlTCS作用后，S期細胞比例明顯增加，而G2/M期細胞比例相應減少。(3)100μg/mlTCS作用HeLa細胞24h后，細胞膜表面的微絨毛減少，細胞核固縮變形，染色質(zhì)濃縮成塊狀，邊集于核膜。TCS作用48h后，細胞膜表面出現(xiàn)典型的細胞凋亡特征——微絨毛基本消失，胞膜發(fā)泡，并可見凋亡小體，核

8、染色質(zhì)高度濃縮，核膜消失，出現(xiàn)廣泛的空泡化和一個非常光滑的表面。(4)同一濃度(100μg/ml)TCS作用HeLa細胞24、36和48h，細胞凋亡率隨著作用時間的延長而逐漸增高；不同濃度的TCS作用HeLa細胞48h，藥物誘導細胞凋亡的作用呈現(xiàn)濃度依賴性增高的趨勢。100μg/mlTCS作用48h，HeLa細胞凋亡率達到最高的42.52％。(5)同一濃度(100μg/ml)TCS分別作用HeLa細胞24、36、48h和不同濃度TCS分

9、別作用HeLa細胞48h后，Caspase-3酶原蛋白條帶逐漸變細，經(jīng)圖像分析后發(fā)現(xiàn)，Caspase-3酶原和內(nèi)參照β-actin的光密度積分值之比有減少的趨勢，呈現(xiàn)時間和濃度依賴性。結果提示，在TCS誘導HeLa細胞凋亡的過程中，Caspase-3酶原發(fā)生了裂解而被活化。(6)用100μg/ml的TCS分別處理HeLa細胞12、24、36和48h后，隨著作用時間的延長，各組Caspase-3mRNA的條帶逐漸變粗，經(jīng)圖像分析可見，各濃

10、度組的Caspase-3mRNA和β-actin光密度積分值之比有隨著濃度增加而增高的趨勢。(7)比色法檢測Caspases活性的結果顯示，Caspase-3，8，9活性均有時間依賴性增高的趨勢。100μg/mlTCS處理24h后，Caspase-8的活性最高，且明顯高于對照組；而同樣濃度處理36h后，Caspase-3的活性開始高于對照組，至48h達到高峰(是對照組的2.8倍)。Caspase-9的活性是在100μg/mlTCS作用3

11、6h后才明顯高于對照組的，但顯著低于Caspase-3。這些結果提示，Caspases的激活具有時間順序，且Caspase-8，9可能參與了Caspase-3的活化過程。 結論 本實驗結果發(fā)現(xiàn)，TCS對HeLa細胞的生長有明顯的抑制作用，其作用機制可能有二，一是由于TCS可以俘獲S期的HeLa細胞；二是TCS可誘導HeLa細胞發(fā)生凋亡。在TCS誘導HeLa細胞凋亡的過程中，Caspase-3的激活是介導HeLa細胞發(fā)生凋亡的共