天花粉蛋白對宮頸癌Caski細胞DNMT1基因表達及酶活性的影響.pdf

1、目的:研究反義 DNMT1對人宮頸癌 Caski細胞增殖和生長周期的影響,以及對Caski細胞中抑癌基因 APC(Adenomatous Polyposis Coli APC)的表達及其5ˊ端啟動子區(qū) CpG島甲基化狀態(tài)的影響;研究天花粉(Trichosanthin,TCS)蛋白對宮頸癌 Caski細胞 DNMT1( DNA- methyltransferase,DNMT)基因的表達和酶活性的影響,并探討天花粉蛋白抗宮頸癌及去甲基作用的

2、分子機制,尋找新型去甲基化藥物。
　　方法:利用成功構(gòu)建的反義 DNMT1真核表達質(zhì)粒 pCMV-THM轉(zhuǎn)染 Caski細胞,G418篩選,RT-PCR和Western- blotting法鑒定低表達 DNMT1的細胞株,MTT法、流式細胞術(shù)分析反義 DNMT1基因轉(zhuǎn)染對 Caski細胞增殖的影響;RT- PCR、實時熒光定量 PCR、Western-blotting和甲基化特異性 PCR法研究反義 DNMT1基因轉(zhuǎn)染對 Cask

3、i細胞 APC的表達及甲基化狀態(tài)的影響。應(yīng)用RT-PCR、實時熒光定量 PCR和Western-blotting分析檢測天花粉蛋白對宮頸癌 Caski細胞 DNMTI基因表達的影響;應(yīng)用DNMT1酶活性試劑盒檢測天花粉蛋白對 DNMT1酶活性的影響。
　　結(jié)果:(1)成功獲得低表達 DNMT1基因的Caski細胞株,細胞生長實驗顯示 DNMT1低表達對細胞增殖有抑制作用,并能夠顯著增加 G1期的細胞數(shù)(由50.1％增加到58％)。

4、(2)轉(zhuǎn)染 pCMV-THM質(zhì)粒的Caski細胞中APC基因 mRNA表達水平升高3.45倍,同時 APC蛋白表達水平也明顯升高;MSP法檢測發(fā)現(xiàn) DNMT1表達抑制導致 APC基因啟動子區(qū)去甲基化。(3)經(jīng)20、40、80?g/ml天花粉蛋白處理24h后,Caski細胞中DNM1基因 mRNA表達水平分別降低了39％、72％、79％,其蛋白表達水平也隨著藥物濃度增高而明顯降低;用DNMT1活性試劑盒檢測顯示20、40?g/ml天花粉蛋

5、白對 DNMT1酶抑制率分別是31.3％和56.7％。
　　結(jié)論:(1)在人宮頸癌 Caski細胞中DNMT1為高表達,降低 DNMT1基因表達水平能抑制細胞的增殖,提示 DNMT1可作為宮頸癌治療的一個靶點。(2)Caski細胞低表達 DNMT1能誘導啟動子區(qū) CpG島去甲基化而使 APC基因表達上調(diào),從而恢復抑癌基因的功能。(3)天花粉蛋白去甲基化的作用可能是通過降低 DNMTs的表達和抑制DNMTs的活性而實現(xiàn)的。上述研究提