天花粉蛋白抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長及分子機制研究.pdf

1、結(jié)腸癌(colorectal cancer，CRC)是人類疾病中常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病率位居人類惡性腫瘤第三位。臨床上多表現(xiàn)為消瘦、貧血、便血、腹痛等，其易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，約50％患者發(fā)現(xiàn)時已發(fā)生肝轉(zhuǎn)移，因此患者在病程后期常因梗阻性黃疸、肝衰竭等原因死亡。目前結(jié)腸癌治療上雖然以外科手術(shù)為主，但是藥物抗腫瘤治療亦是重要治療手段，有助于患者病情的控制，提高患者生命質(zhì)量。
　　人類惡性腫瘤的發(fā)生不僅與細(xì)胞的異常增生有關(guān)，還與細(xì)胞的凋

2、亡受阻，致使腫瘤細(xì)胞無限制惡性增生有密切關(guān)系。惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移過程中包括血管生成、細(xì)胞粘附、侵襲、轉(zhuǎn)移及增殖等等。因此，細(xì)胞凋亡在控制腫瘤細(xì)胞增殖、腫瘤發(fā)生及腫瘤生長過程中起到至關(guān)重要的作用?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，一些中國傳統(tǒng)中藥具有很好的抑制腫瘤生長作用。
　　天花粉為葫蘆科植物瓜蔞或雙邊瓜蔞的干燥根，現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)其具有終止妊娠、抗腫瘤、抗炎抑菌、抗病毒等多種藥理活性。天花粉蛋白(Trichosanthin，TCS)是一種從中

3、藥瓜蔞塊根中分離提純的有效成分，屬于Ⅰ型核糖體失活蛋白，具有RNAN-糖苷酶活性，能夠水解真核細(xì)胞核糖體28S rRNA特定位點的腺苷酸，從而抑制細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成。既往實驗發(fā)現(xiàn)，TCS具有潛在的抗腫瘤作用。
　　本文研究天花粉蛋白抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長作用，并在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行天花粉蛋白及其突變體Y(酪氨酸)70A(丙氨酸)、R（精氨酸）163Q（谷氨酰胺）TCS生物活性功能研究。結(jié)果顯示:(1) TCS對結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞的生長有明顯

4、的抑制作用，HCT116細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞皺縮、變形，并且細(xì)胞凋亡呈現(xiàn)明顯的濃度和時間依賴性;(2) TCS可將結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞阻滯于S期;(3) TCS可誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞發(fā)生凋亡;(4) Western blotting檢測結(jié)果顯示caspase-3酶原，caspase-9酶原，PARP表達(dá)降低，呈現(xiàn)濃度依賴性。TCS處理可活化Akt、pAkt上升;(5)在細(xì)胞內(nèi)，野生種TCS能抑制熒光素酶活性，突變體Y70A則不能抑制熒光素酶活

5、性，而突變種R163Q對熒光素酶活性抑制作用強于野生種TCS。
　　本研究共分為兩部分內(nèi)容。
　　第一部分TCS抑制結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞生長作用的研究
　　研究目的:研究天花粉蛋白(Trichosanthin，TCS)對人結(jié)腸癌細(xì)胞生長抑制的影響。
　　研究方法:人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞，分設(shè)TCS實驗組（濃度分別為7.0μM、14μM、28μM）和陰性對照組。實驗中(1)采用倒置顯微鏡觀察TCS對HCT116

6、細(xì)胞形態(tài)及增殖的影響;(2)采用流式細(xì)胞儀檢測TCS對HCT116細(xì)胞周期以及TCS對HCT116細(xì)胞凋亡影響;(3)應(yīng)用Western blotting檢測結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞caspase-3酶原，caspase-9酶原;PARP; pAkt;Akt變化。
　　研究結(jié)果:(1) TCS處理明顯抑制結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞的生長，HCT116細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞皺縮、變形，體積變小，并且細(xì)胞凋亡呈現(xiàn)明顯的濃度和時間依賴性;(2) TCS

7、可將結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞阻滯于S期;(3) TCS可誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞發(fā)生凋亡;(4) Western blotting法檢測結(jié)果顯示caspase-3酶原，caspase-9酶原，PARP表達(dá)降低，呈濃度依賴性。TCS處理激活A(yù)kt，磷酸化Akt升高。
　　研究結(jié)論:TCS可抑制結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞生長，呈藥物濃度和作用時間依賴性。TCS可將HCT116細(xì)胞阻滯于S期，并誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞凋亡。caspase-9、cas

8、pase-3的激活為介導(dǎo)TCS誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞發(fā)生凋亡的通路，結(jié)果提示與PI3K/Akt通路調(diào)節(jié)有關(guān)系。
　　第二部分天花粉蛋白及其突變體Y70A、R163Q TCS生物活性研究
　　研究目的:在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行天花粉蛋白野生種(TCS)及天花粉蛋白突變體Y70A、R163Q TCS生物活性比較;
　　研究方法:以pAAV-CMV-TCS為載體，通過定點突變、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增、提取、測序、轉(zhuǎn)染等方法構(gòu)建突變種Y70A、R1

9、63Q TCS。在細(xì)胞內(nèi)通過熒光素酶活性測定，進(jìn)行野生種TCS與突變種TCS活性比較。
　　研究結(jié)果:熒光素酶報告基因檢測，單獨或與野生種TCS、突變種Y70A、R163Q共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。在細(xì)胞內(nèi)，野生種TCS能抑制熒光素酶活性，突變種Y70A則不能抑制熒光素酶活性，而突變種R163Q對熒光素酶活性抑制作用強于野生種TCS。
　　研究結(jié)論:通過野生種TCS，突變種Y70A和R163Q在細(xì)胞內(nèi)對熒光素酶活性影響的比較，結(jié)果