天花粉蛋白對(duì)肺癌A549細(xì)胞骨架微管結(jié)構(gòu)及相關(guān)JNK信號(hào)途徑的研究.pdf

1、現(xiàn)代研究
　　揭示肺癌是一種生物行為較為復(fù)雜的惡性疾病，目前已成為威脅人類健康和生存質(zhì)量的重大世界性難題。近年來(lái)，隨著對(duì)肺癌發(fā)病的病生理機(jī)制研究的不斷深入，多學(xué)科相互交叉以及特異性靶點(diǎn)治療的廣泛應(yīng)用，肺癌的個(gè)體化診治水平取得了令人矚目的進(jìn)步。與此同時(shí)，中醫(yī)藥作為一種常規(guī)治療手段在肺癌的治療中顯示出相當(dāng)?shù)膬?yōu)勢(shì)和潛力，但對(duì)其抗癌機(jī)理尚缺乏明確的基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)闡述和系統(tǒng)的總結(jié)，影響了相關(guān)中藥效能機(jī)制的挖掘和臨床應(yīng)用的廣泛推廣。天花粉是我國(guó)傳統(tǒng)

2、中草藥，天花粉蛋白作為其有效提取物質(zhì)之一，具有中晚期引產(chǎn)、抗腫瘤、提高機(jī)體免疫力、抗人體免疫缺陷等多種藥理學(xué)特性[1]，目前已成為傳統(tǒng)中醫(yī)藥抗腫瘤的潛在性藥物。其對(duì)正常組織毒副作用較小、抗癌譜廣、價(jià)格低廉，較傳統(tǒng)化療藥物有著顯著的優(yōu)勢(shì)，因而受到了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。
　　前期試驗(yàn)研究
　　已初步證實(shí)天花粉蛋白對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞株具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖的作用;天花粉蛋白誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制主要與阻滯細(xì)胞分裂周期

3、以及誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)JNK信號(hào)通路活化有關(guān)。細(xì)胞骨架—微管結(jié)構(gòu)作為天花粉蛋白在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的作用另一個(gè)靶點(diǎn)，主要是通過(guò)抑制微管的聚合而干擾有絲分裂期紡錘體的形成，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)骨架結(jié)構(gòu)甚至整個(gè)細(xì)胞功能結(jié)構(gòu)的改變，同時(shí)也使細(xì)胞分裂停止于有絲分裂的S期，最終引起了腫瘤細(xì)胞的凋亡。可見(jiàn)，TCS誘導(dǎo)凋亡和細(xì)胞重構(gòu)是高度協(xié)調(diào)一致的。這些研究結(jié)果初步證實(shí)肺癌A549細(xì)胞株是天花粉蛋白的敏感細(xì)胞株之一，其可有效地誘導(dǎo)人肺癌A549細(xì)胞的凋亡。然而，在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

4、過(guò)程中天花粉蛋白特異性的分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制仍需要進(jìn)一步的研究。
　　目的:本文旨在通過(guò)觀察天花粉蛋白誘導(dǎo)人肺癌A549細(xì)胞凋亡過(guò)程中細(xì)胞骨架的改變，及相關(guān)JNK信號(hào)傳導(dǎo)通路或靶點(diǎn)的調(diào)節(jié)作用，以便從細(xì)胞和分子水平上揭示天花粉蛋白誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的機(jī)理，為天花粉蛋白在腫瘤防治中的應(yīng)用提供重要的實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。
　　方法:常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞，MTT法、CCK法測(cè)定對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用，倒置顯微鏡、Hoechst33342熒光

5、染色和透視電鏡下觀察凋亡細(xì)胞以及超微結(jié)構(gòu)變化。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率及各細(xì)胞周期的變化、蛋白免疫印跡雜交法（Western-blot法）檢測(cè)caspase-3、deaved-caspase-3、JNK、p-JNK、c-Jun、細(xì)胞骨架蛋白的表達(dá)及實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證基因表達(dá)。觀察天花粉蛋白及在此基礎(chǔ)上加入JNK特異性抑制劑SP600125對(duì)人肺癌A549細(xì)胞株的JNK通路的影響及其細(xì)胞骨架微管結(jié)構(gòu)的改變。
　　結(jié)果:1.天花粉蛋白

6、對(duì)肺癌A549細(xì)胞凋亡過(guò)程中細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)和細(xì)胞周期的研究:MTT法測(cè)定A549細(xì)胞增殖的抑制，通過(guò)不同TCS分別作用于A549細(xì)胞24、48、72h，A549細(xì)胞抑制率隨著藥物濃度的增加、作用時(shí)間延長(zhǎng)而呈上升趨勢(shì)，且與空白對(duì)照組相比，P＜0.05; Hoechst33342結(jié)合熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，空白對(duì)照組細(xì)胞呈圓形，大小較一致，細(xì)胞膜完整，呈彌散且均勻分布的淡藍(lán)色弱熒光。TCS作用后，A549細(xì)胞呈典型凋亡細(xì)胞形態(tài):胞體較前

7、有所減小，細(xì)胞核發(fā)生固縮，甚至裂成碎片，胞質(zhì)濃縮，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)內(nèi)形成多個(gè)有膜包被的凋亡小體結(jié)構(gòu)，細(xì)胞內(nèi)散在可見(jiàn)深染且密度均一的熒光樣顆粒，甚至可存在DNA熒光碎片;透視電鏡觀察TCS對(duì)肺癌A549細(xì)胞有明顯抑制作用，可見(jiàn)A549肺癌細(xì)胞表面微絨毛消失，體積變小，核染色質(zhì)呈新月形聚集于細(xì)胞邊緣;流式細(xì)胞PI染色（單染）檢測(cè)人肺癌細(xì)胞A549的周期和凋亡，空白組、12.5、25、50μg/ml的TCS作用A549細(xì)胞24、48h后的凋亡率((

8、x)±s)分別為0.45±0.21、0.51±0.47、0.74±0.33、2.31±0.53和0.67±0.47、2.38±0.96、2.43±1.12、3.78±1.48。流式結(jié)果還顯示，不同濃度的天花粉蛋白對(duì)細(xì)胞周期的影響是G1期時(shí)限縮短，而S期期限增加，Sub-G1和G2/M期則變化不大。但是，50μg/ml濃度的天花粉蛋白對(duì)細(xì)胞周期的作用不明顯。2.天花粉蛋白對(duì)肺癌A549細(xì)胞凋亡信號(hào)Caspase-3表達(dá)的影響:免疫熒光印跡

9、測(cè)定TCS對(duì)肺癌細(xì)胞A549 Caspase-3表達(dá)水平，TCS組藥物濃度為25μg/ml始由無(wú)活性的pro-caspase-3逐漸被裂解的deaved-caspase-3片段即代表具有活性的caspase-3，并在12.5、25、50μg/ml組活化作用逐漸增強(qiáng)。與此相反，在細(xì)胞凋亡的晚期或是已死亡細(xì)胞中，caspase-3酶原的活性明顯下降，呈低活化或是非活化狀態(tài)。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)TCS通過(guò)JNK通路對(duì)A549肺癌細(xì)胞Caspas

10、e-3 mRNA表達(dá)的研究，TCS處理組隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)基因產(chǎn)物表達(dá)隨之增加，相比于對(duì)照組，P＜0.05。預(yù)先用JNK特異性抑制劑處理后，且與caspase-3抑制劑z-VAD類似，則蛋白表達(dá)量降低;分光光度計(jì)測(cè)定TCS通過(guò)JNK通路對(duì)細(xì)胞Caspase-3相對(duì)活性的改變，自25μg/ml起隨著TCS濃度增加，Caspase-3相對(duì)活性明顯增加(P＜0.05)。其中，100μg/ml的TCS作用A549細(xì)胞時(shí)酶活性達(dá)到最大值，可達(dá)對(duì)照組

11、的2.43倍。加入SP60012510μM后，caspase-3酶相對(duì)活性較前有所下降，且兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。3.TCS對(duì)JNK通路激活的實(shí)驗(yàn)研究:CCK法檢測(cè)TCS通過(guò)JNK通路對(duì)肺癌細(xì)胞A549增殖的影響。與MTT法細(xì)胞干預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，隨著TCS濃度的升高以及處理時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率呈逐漸上升趨勢(shì)。預(yù)先給予JNK特異性抑制劑SP600125作用后，12、24、48h后細(xì)胞抑制率((x)±s)分別為1.823

12、±0.057、1.708±0.042、1.597±0.031，高于單純TCS處理組(1.705±0.049、1.603±0.033、1.542±0.028)，兩組差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);流式細(xì)胞術(shù)AnnexinⅤ/PI（雙染）檢測(cè)肺癌細(xì)胞A549的周期和凋亡，空白組、12.5μg/ml TCS組、25μg/ml TCS組凋亡率((x)±s)分別為0.9％、28.6％、30.4％，顯著高于預(yù)先SP處理組的0.5％、8.5％和2

13、0.5％，兩組數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;Western blot蛋白印跡檢測(cè)TCS對(duì)A549細(xì)胞凋亡過(guò)程中JNK、p-JNK以及下游信號(hào)分子c-Jun的表達(dá)情況。隨著天花粉蛋白濃度的升高，磷酸化JNK(p-JNK)、c-Jun表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)，而JNK表達(dá)水平與天花粉蛋白藥物濃度無(wú)明顯變化(P＞0.05)。其中蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組(P＜0.05);免疫熒光共聚焦顯微鏡下，0、12.5、25、50μ g/ml天花粉蛋白

14、作用A549細(xì)胞1h后，相比對(duì)照組，隨著TCS濃度增加c-Jun在核內(nèi)表達(dá)水平明顯上升，但12.5μg/ml濃度的TCS組較對(duì)照組并沒(méi)有發(fā)生明顯的改變。4.天花粉蛋白對(duì)肺癌A549細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)及其細(xì)胞骨架微管結(jié)構(gòu)的影響:免疫熒光法檢測(cè)TCS對(duì)微管結(jié)構(gòu)的影響。用0和30μg/ml兩個(gè)不同濃度的天花粉蛋白作用1h，聚焦顯微鏡下正常細(xì)胞胞質(zhì)中可見(jiàn)清晰的微管蛋白結(jié)構(gòu)，呈細(xì)絲狀且胞核可見(jiàn)密度均勻的藍(lán)色顆粒;30μg/ml濃度的TCS作用1h后，

15、細(xì)胞核呈典型的凋亡形態(tài)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)微管蛋白密度減低，部分細(xì)絲狀的微管結(jié)構(gòu)消失，呈解聚的狀態(tài)。與之相比，用SP600125預(yù)處理后的TCS組并無(wú)微管結(jié)構(gòu)的改變。免疫印跡法檢測(cè)微管蛋白的表達(dá)。TCS作用后α-tubulin發(fā)生乙酰化，且隨著藥物劑量的增加其表達(dá)水平明顯下降，在TCS濃度為50μg/ml時(shí)達(dá)到最低值;RT-PCR檢測(cè)骨架蛋白(β-actin、γ-actin)以及微管蛋白亞型基因(α-tubulin、β-tubulin)的表達(dá)。對(duì)

16、照組細(xì)胞內(nèi)四種mRNAs的拷貝數(shù)隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高;然而，TCS處理組細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞骨架mRNAs的水平較前降低，尤其是actin基因。
　　結(jié)論:
　　(1)天花粉蛋白能夠明顯抑制肺癌細(xì)胞A549的增殖，其機(jī)制可能是天花粉蛋白通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡與阻滯細(xì)胞分裂周期于S期雙重作用機(jī)制所致;
　　(2)在天花粉蛋白誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞A549凋亡過(guò)程中，可影響相關(guān)腫瘤細(xì)胞凋亡信號(hào)通路的激活，伴有促凋亡基因Caspase-3的表達(dá)