天花粉蛋白誘導產(chǎn)生調節(jié)性T細胞、促進CD4+CD25+Treg增殖分化.pdf

1、為了解天花粉蛋白(Trichosanthin,Tk)誘導免疫抑制的機制，并探索其作為一種免疫調節(jié)劑用于器官移植免疫排斥反應特異性治療的可行性，本文從下述兩方面進行了研究。 一、天花粉蛋白誘導CD4+CD25-T細胞向CD4+CD25+Foxp3+Treg分化 已有的研究顯示，低劑量天花粉蛋白(100ng/ml)通過下調樹突狀細胞(dendreticcells,DC)表面共刺激分子CD80和LFA-1的表達，阻止DC成熟誘

2、導免疫抑制。 DC是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強的抗原呈遞細胞(APC)，也是唯一能激活初始型T細胞的APC，具有雙向調節(jié)作用，是移植免疫的中樞。不同分化狀態(tài)、不同亞型的DC具有不同的功能，成熟DCs(mDCs)能有效地激活初始型T細胞，并產(chǎn)生免疫記憶；非成熟DCs(iDCs)能誘導初始型T淋巴細胞免疫耐受。大量的研究證明，iDC誘導初始型T細胞向調節(jié)性T細胞分化，通過后者介導免疫耐受。 既然天花粉蛋白通過阻止DC成熟誘導免疫抑制

3、，那么其免疫抑制作用可能與調節(jié)性T細胞密切相關。因此，我們推測：天花粉蛋白誘導CD4+CD25-T細胞向CD4+CD25+Foxp3+Treg分化，并通過后者介導免疫抑制。 為了驗證推測，本部分做了以下研究： 實驗方法：1、用免疫磁珠方法(MACS)分選小鼠CD4+CD25-T細胞，流式細胞術測定純度。 2、在低劑量Tk(100ng/ml)存在的條件下，用Balb/c鼠滅活脾細胞刺激C57BL/6鼠CD4+CD2

4、5-T細胞誘導培養(yǎng)4周，以滅活的C57BL/6脾細胞為APC，以不加Tk組為對照；用流式細胞術測定培養(yǎng)2、4周后CD4+CD25+T細胞的轉化率。 3、用MACS方法分選上述培養(yǎng)系統(tǒng)中不同實驗組培養(yǎng)4周的CD4+CD25+T細胞，RT-PCR測定Foxp3表達。 4、用anti-CD3刺激不同實驗組培養(yǎng)4周的CD4+CD25+T細胞48小時，ELISA法測定培養(yǎng)上清液中IL-10和TGF-β的含量。 5、混合淋巴

5、細胞反應技術測定不同實驗組培養(yǎng)4周的CD4+CD25+T細胞的免疫抑制功能。 6、測定Tk誘導出的CD4+CD25+T細胞(Tk-Treg，C57BL/6MHC背景，Balb/cMHC抗原特異性)抑制T細胞增殖的抗原特異性(Balb/c滅活脾細胞為刺激細胞，昆明鼠滅活脾細胞為無關抗原對照，C57BL/6T細胞為反應細胞)。 結果：1、MACS方法分選小鼠CD4+CD25-T細胞純度達99.2％； 2、誘導培養(yǎng)2周

6、時Tk誘導組和對照組CD4+CD25+T細胞分別占總細胞數(shù)的35％和11％，4周時分別占38％和37％； 3、Tk誘導組CD4+CD25+T細胞(Tk-Treg)Foxp3基因高表達，而對照組CD4+CD25+T細胞(A-CD4+CD25+T)不表達Foxp3； 4、Tk誘導組CD4+CD25+T細胞分泌大量IL-10和中等量的TGF-β，48小時培養(yǎng)上清液中TGF-β和IL-10含量分別為1386±157.3pg/ml

7、和1893±198.6pg/ml，而對照組含量極低分別為212±25.7pg/ml和252±28.2pg/ml，差異顯著(p＜0.01)； 5、當CD4+CD25+T：CD4+CD25-T細胞比例為1∶1，1∶2，1∶4，1∶8時，Tk誘導組Tk-Treg對CD4+CD25-T細胞增殖抑制百分率分別為：80±3.7％、77±3.5％和75±3.8％、39.5±1.7％，抑制呈劑量依賴性。而對照組A-CD4+CD25+T細胞無抑制

8、功能； 6、當CD4+CD25+T：CD4+CD25-T細胞比例為1∶1，1∶2，1∶4，1∶8時，Tk-Treg對Balb/c滅活脾細胞為抗原刺激的T細胞增殖抑制百分率分別為：(同上)；而對無關對照抗原刺激的T細胞增殖抑制百分率分別為：17.5±3.1％、11±2.8％、7±1.2和6±1.8％。差異顯著(p值均＜0.01)，表明，Tk-Treg抑制T細胞增殖具有抗原特異性。 結論：1、Tk誘導初始型CD4+CD25-

9、T細胞向CD4+CD25+調節(jié)性T細胞分化，通過后者介導免疫耐受。 2、Tk-Treg免疫抑制作用具有抗原特異性。 二、天花粉蛋白促進CD4+CD25+Treg增殖和分化TGF-β是免疫抑制性細胞因子，既能誘導CD4+CD25-T細胞向CD4+CD25+Foxp3+Treg分化，又能促進CD4+CD25+Treg增殖、分化。 已有的研究顯示，在免疫抑制作用機制和功能上，Tk與TGF-β存在許多相似之處。那么，探索

10、Tk在促進CD4+CD25+Treg增殖和分化中的作用就有可靠的理論依據(jù)，將從另外一個層面深入揭示Tk誘導免疫抑制的機制，同時也為CD4+CD25+Treg體外大量擴增和臨床應用奠定基礎。本部分就Tk在促進CD4+CD25+Treg增殖和分化中的作用進行了研究。 實驗方法：1、MACS方法分選新鮮分離的CD4+CD25+T細胞(F-Treg)； 2、混合淋巴細胞反應(MLR)技術擴增F-Treg，分5組：A組：反應體系中

11、含照射過的刺激方APC、反應方APC，反應方F-Treg、IL-2(100ng/ml)，擴增得到N-Treg； B組：F-Treg含在IL-2(100ng/ml)、10％胎牛血清(FCS)的RMPl1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，體系中不含刺激方APC、反應方APC； C組：在A組基礎上加不同濃度Tk，擴增得到Tk-TregD組：在A組基礎上加TGF-β和不同濃度Tk，擴增得到Tt-Treg；E組：在A組基礎上加TGF-β，不加T

12、k，擴增得到T-Treg； 細胞在含10％胎牛血清(FCS)、2ME(50uM)的RMPI1640培養(yǎng)液中，5％C02環(huán)境下培養(yǎng)擴增14天。 3、擴增后細胞臺盼蘭染色計活細胞總數(shù)，流式細胞術測定純度，計算各組擴增效率。 4、、RT-PCR測定各組CD4+CD25+T細胞FoxP3mRNA。 5、混合淋巴細胞反應技術測定擴增后各組CD4+CD25+T細胞對T淋巴細胞增殖的抑制率。 6、混合淋巴細胞反

13、應技術測定擴增后各組CD4+CD25+T細胞對T淋巴細胞增殖抑制的抗原特異性。 結果：1、MACS方法分選小鼠F-Treg純度達到99.6％。 2、擴增2周各組的擴增效率A組：CD4+CD25+T細胞擴增115±10倍； B組：基本無擴增； C組：當Tk終濃度為800、400、200、100、50、25ng/ml時，CD4+CD25+T擴增效率分別為120±11、131±7、145±8、172±10、16

14、4±9,150±8倍，與A組(不含Tk)相比，擴增效率顯著提高(除Tk終濃度為800ng/ml外，p值均＜0.05)，Tk濃度為100ng/ml時，擴增效率最高。 D組：當Tk終濃度為800、400、200、100、50、25ng/ml時(與TGF-β1ng/ml聯(lián)合應用)，擴增效率分別為140±12，155±14，168±18，195±20，180±16，165±10倍，與C組相比，擴增效率顯著提高(p值均＜0.05)。

15、 E組：擴增152±11倍。 3、各組擴增后的CD4+CD25+T細胞表面均高表達Foxp3。 4、在相同的Treg：CD4+CD25-T比例(1∶1，1∶2，1∶4，1∶8)下，N-Treg、Tk-Treg、T-Treg對T淋巴細胞增殖的抑制率均高于F-Treg(新鮮分離的CD4+CD25+Tr)，p值均＜0.05。 5、N-Treg、Tk-Treg、T-Treg對T淋巴細胞增殖的抑制均具有抗原特異性。