Akt信號(hào)通路通過(guò)激活TFEB而抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡.pdf

1、機(jī)體內(nèi)氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡所引起的氧化應(yīng)激（oxidative stress，OS），可造成細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、RNA、DNA的損傷。氧化應(yīng)激過(guò)程中產(chǎn)生的活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）介導(dǎo)脂質(zhì)過(guò)氧化、降低NO生物活性、以及激活炎癥基因等一系列病理生理學(xué)反應(yīng)。越來(lái)越多的研究表明，氧化應(yīng)激可以誘發(fā)多種疾病，例如神經(jīng)退行性疾?。╪eurodegenerative disease）、動(dòng)脈硬化、以及糖尿病等。在中

2、樞神經(jīng)系統(tǒng)中，過(guò)量的ROS可以導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞活化、神經(jīng)元以及星形膠質(zhì)細(xì)胞的損傷。帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是一種中樞系統(tǒng)慢性退行性疾病，其病理特征為多巴胺神經(jīng)元選擇性和漸進(jìn)性退化以及由氧化應(yīng)激誘發(fā)的神經(jīng)元凋亡。
　　Akt，又稱蛋白激酶B（PKB），是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。該激酶可以調(diào)控細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷徙以及細(xì)胞凋亡。最近有研究表明，Akt信號(hào)通路介導(dǎo)神經(jīng)元的存活，對(duì)PD患者的神經(jīng)元有保護(hù)作用。

3、例如，Akt/Rheb的激活可以使中樞神經(jīng)系統(tǒng)的軸突再生，并且在PD病人的腦組織中，Akt的表達(dá)和磷酸化水平明顯降低。對(duì)Akt作用機(jī)理的研究證實(shí)，Akt可以通過(guò)磷酸化多種凋亡相關(guān)蛋白來(lái)抑制細(xì)胞凋亡。但Akt信號(hào)通路對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡有何影響目前尚不清楚。
　　TFEB（transcription factor EB），是亮氨酸拉鏈bHLH-Zip轉(zhuǎn)錄因子家族中MiT/TFE家族中的成員。有文章報(bào)道，TFEB參與溶酶體合成

4、和功能的調(diào)節(jié)，調(diào)控細(xì)胞自噬，并與神經(jīng)退行性疾病、癌癥、以及溶酶體貯積癥等多種疾病相關(guān)。最近有報(bào)道稱，過(guò)表達(dá)TFEB可以防止MPTP誘導(dǎo)的多巴胺神經(jīng)元凋亡；TFEB的激活能減輕α-synuclein在腦組織中的異常聚集以及氧化應(yīng)激和炎癥造成的神經(jīng)細(xì)胞的損傷。盡管既往研究已經(jīng)證實(shí)， Akt信號(hào)通路和TFEB均參與了細(xì)胞存活和細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)，但是在氧化應(yīng)激條件下，Akt信號(hào)通路和TFEB之間在功能上的聯(lián)系尚待闡明。本研究旨在探討Akt信號(hào)通路

5、和TFEB之間如何協(xié)同拮抗氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。
　　第一部分：TFEB介導(dǎo)Akt信號(hào)通路對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡的抑制作用
　　目的：
　　探討Akt信號(hào)通路對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響，明確Akt信號(hào)通路和TFEB在拮抗過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡中的相互關(guān)系。
　　方法：
　　1.MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度的過(guò)氧化氫對(duì)SH-SHY5Y細(xì)胞活力的影響及其與Akt信號(hào)通路的關(guān)系。
　　2

6、.Western blot檢測(cè)不同濃度的過(guò)氧化氫對(duì) Akt磷酸化及其與PARP活化之間的關(guān)系。
　　3.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)阻斷Akt信號(hào)通路后過(guò)氧化氫對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，以及過(guò)表達(dá)TFEB阻斷或激活A(yù)kt信號(hào)通路對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響。
　　4.免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TFEB與Akt的結(jié)合。
　　結(jié)果：
　　1.Akt信號(hào)通路在過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的SH-SHY5Y細(xì)胞凋亡中受到抑制因Akt信號(hào)通路介導(dǎo)生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)

7、胞的生存，且過(guò)多的ROS損傷神經(jīng)細(xì)胞，所以我們首先檢測(cè) Akt信號(hào)通路是否在過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的SH-SHY5Y細(xì)胞凋亡中受到的影響。用不同濃度的過(guò)氧化氫處理SH-SHY5Y細(xì)胞，MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)氧化氫濃度在100μM和200μM時(shí)，SH-SHY5Y細(xì)胞活力輕微增加；而過(guò)氧化氫濃度在400μM和800μM時(shí)，SH-SHY5Y細(xì)胞活力顯著降低。Western blot結(jié)果顯示，當(dāng)SH-SHY5Y細(xì)胞給予400μM和800μM的過(guò)氧化氫時(shí)，

8、Akt磷酸化水平顯著降低，說(shuō)明在過(guò)氧化氫誘導(dǎo)SH-SHY5Y細(xì)胞凋亡過(guò)程中Akt信號(hào)通路受到抑制。
　　流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，當(dāng)用Akt和PI3K抑制劑 wortmannin預(yù)處理后，再給予400μM的過(guò)氧化氫刺激時(shí)，氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡明顯加重。Western blot結(jié)果也顯示，Akt和 PI3K抑制劑可以完全阻斷Akt的磷酸化，并且細(xì)胞凋亡標(biāo)志物的剪切即cleaved-PARP顯著增加。另外，用持續(xù)激活的HA-Akt-C

9、A或它的失活突變體HA-Akt-KD轉(zhuǎn)染SH-SHY5Y細(xì)胞后，給予過(guò)氧化氫刺激。MTT結(jié)果顯示，HA-Akt-CA轉(zhuǎn)染的SH-SHY5Y細(xì)胞受到過(guò)氧化氫刺激后，其凋亡率顯著降低。綜上所述，這些結(jié)果表明，Akt信號(hào)通路在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡中受到抑制。
　　2.TFEB抑制過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的SH-SHY5Y細(xì)胞凋亡與Akt信號(hào)通路相關(guān)
　　因?yàn)門(mén)FEB抑制細(xì)胞凋亡，所以我們進(jìn)一步檢測(cè)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的SH-SHY5Y細(xì)胞凋亡是

10、否受TFEB的影響。用重組腺病毒Flag-TFEB感染SH-SHY5Y細(xì)胞后，用Western blot和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。在TFEB過(guò)表達(dá)的細(xì)胞中，過(guò)氧化氫引起的PARP的活化受到抑制，并且Akt抑制劑能減少TFEB過(guò)表達(dá)抑制的PARP的活化。同樣，在TFEB過(guò)表達(dá)的細(xì)胞中，再給予Akt信號(hào)通路的激活劑EGF時(shí)，過(guò)氧化氫引起的PARP的活化被取消。我們發(fā)現(xiàn)，不管是否給予過(guò)氧化氫刺激，在SH-SHY5Y細(xì)胞中過(guò)表達(dá)TFEB均會(huì)顯著

11、抑制細(xì)胞凋亡。
　　為了進(jìn)一步檢測(cè)TFEB抑制細(xì)胞凋亡是否與Akt信號(hào)通路相關(guān)，用Akt inhibitor或Akt激活劑EGF預(yù)處理細(xì)胞后，再給予過(guò)氧化氫刺激。流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)TFEB可以顯著減少由Akt inhibitor和過(guò)氧化氫共同引起的細(xì)胞凋亡。相反，Akt信號(hào)通路的激活劑EGF減少氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡，過(guò)表達(dá)TFEB的細(xì)胞再給予EGF處理可進(jìn)一步減少過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果表明，TFEB抑制氧化應(yīng)

12、激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡受Akt信號(hào)的調(diào)節(jié)。
　　3.TFEB與Akt存在相互作用
　　上述研究證實(shí)，TFEB抑制SH-SHY5Y細(xì)胞凋亡受Akt信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，我們進(jìn)一步研究Akt是否可以直接與TFEB相互作用。用野生型的HA-Akt-WT和GST-TFEB轉(zhuǎn)染細(xì)胞，GST pull down實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HA-Akt可以直接與GST-TFEB結(jié)合，但不與GST相互作用。用免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)內(nèi)源性的Akt是否與TFEB結(jié)合，結(jié)果顯

13、示，在TFEB抗體的免疫沉淀物中檢測(cè)到Akt蛋白的存在。為了進(jìn)一步驗(yàn)證TFEB的哪個(gè)結(jié)構(gòu)域與Akt結(jié)合，用可表達(dá)全長(zhǎng)TFEB及其不同結(jié)構(gòu)域的表達(dá)載體GST-TFEB-FL/GST-TFEB-1-294/GST-TFEB-295-476和HA-Akt-WT共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，通過(guò)GST pull down實(shí)驗(yàn)檢測(cè)全長(zhǎng)TFEB（TFEB-FL）和各種截短突變體與Akt的結(jié)合情況。結(jié)果顯示，全長(zhǎng)TFEB（TFEB-FL）和包含HLH結(jié)構(gòu)

14、域的N端結(jié)構(gòu)域（TFEB-1-294）可以與Akt的結(jié)合。當(dāng)TFEB的N端結(jié)構(gòu)域（TFEB-1-294）被消除時(shí)，突變體喪失與Akt的結(jié)合。
　　為了進(jìn)一步檢測(cè)TFEB與Akt的結(jié)合是否受Akt活性的影響，將持續(xù)激活型Akt(HA-Akt-CA)/失活型Akt(HA-Akt-KD)/部分失活型Akt(HA-Akt-*KD)和GST-TFEB共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，GST pull down結(jié)果顯示，TFEB與不同活性形式的Akt

15、均可結(jié)合。持續(xù)激活型Akt與TFEB結(jié)合能力最強(qiáng)，失活型Akt與TFEB的結(jié)合最少。為了進(jìn)一步檢測(cè)Akt不同結(jié)構(gòu)域與TFEB結(jié)合的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TFEB不能與Akt-PH或者Akt-Cat結(jié)合，但與Akt-tail具有較強(qiáng)的結(jié)合能力。
　　小結(jié):
　　1.Akt信號(hào)通路在過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的SH-SHY5Y細(xì)胞凋亡中受到抑制。
　　2.TFEB通過(guò)與Akt相互作用介導(dǎo)過(guò)氧化氫對(duì)SH-SHY5Y細(xì)胞凋亡的影響。
　　第二

16、部分：Akt磷酸化TFEB的Ser467位點(diǎn)
　　目的：
　　探討Akt是否可以磷酸化TFEB以及Akt對(duì)TFEB進(jìn)行磷酸化修飾的位點(diǎn)。
　　方法：
　　1.用Akt、PI3K和ERK抑制劑處理細(xì)胞，Western blot檢測(cè)TFEB的磷酸化；在SH-SHY5Y細(xì)胞中表達(dá)TFEB和TFEB-S467A并給予insulin或Akt inhibitor處理，Western blot檢測(cè)TFEB-S467位點(diǎn)的磷酸化

17、。
　　2.用TFEB截短突變體和不同磷酸化位點(diǎn)突變體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，Western blot檢測(cè)Akt抑制劑和激活劑insulin對(duì)TFEB-S467磷酸化的影響。
　　3.體外Akt活性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TFEB與Akt共孵育后TFEB-S467的磷酸化。
　　結(jié)果：
　　1.Akt磷酸化TFEB
　　分別用 PI3K抑制劑 Wortmannin、Akt inhibitor和 ERK抑制劑PD98059預(yù)處理過(guò)表達(dá) T

18、FEB的細(xì)胞，然后給予insulin刺激，用p-Akt-substrate抗體檢測(cè)TFEB的磷酸化。Western blot結(jié)果顯示，給予insulin刺激后，Akt-Ser473的磷酸化水平和Akt底物的磷酸化水平顯著升高，PI3K和Akt抑制劑能取消insulin對(duì)TFEB和Akt底物磷酸化的誘導(dǎo)， ERK的抑制劑不影響它們的磷酸化。GST pull down實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，持續(xù)活化型的Akt與Akt底物的結(jié)合多于野生型Akt和失活型

19、的Akt。用GST-TFEB轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞后，再分別給予insulin或者Akt inhibitor刺激。結(jié)果顯示，insulin處理后Akt-Ser473和Akt底物的磷酸化水平升高；而Akt inhibitor抑制Akt-Ser473和Akt底物的磷酸化水平。另外，來(lái)源于HEK293T細(xì)胞中內(nèi)源性TFEB經(jīng)Akt激活劑或者抑制劑處理后得到相同的結(jié)果。這些結(jié)果表明TFEB可以被Akt磷酸化。
　　2.Akt磷酸化TFEB

20、的Ser467位點(diǎn)
　　構(gòu)建可表達(dá)TFEB不同截短突變體的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，用p-Akt-substrate抗體檢測(cè)不同截短突變體的磷酸化。結(jié)果顯示全長(zhǎng)TFEB(TFEB-FL)和它的C-端部分(TFEB-320~476,氨基酸320~476)可以被Akt磷酸化，而N-端部分(TFEB-1~319,氨基酸1~319)卻不能被Akt磷酸化。說(shuō)明TFEB-320~476包含Akt磷酸化位點(diǎn)。當(dāng)TFEB-320~476被進(jìn)一步截短時(shí)，

21、我們發(fā)現(xiàn)，TFEB-352~476(氨基酸352~476)可以被Akt磷酸化，提示TFEB被Akt磷酸化的絲氨酸存在于461到476氨基酸之間。進(jìn)一步把461到476氨基酸之中的絲氨酸都進(jìn)行點(diǎn)突變。Western blot結(jié)果顯示，TFEB-S462A和TFEB-S466A以及野生型的TFEB均可以被Akt磷酸化；相反， TFEB-S463/467A和TFEB-S467/469A突變體不能被Akt磷酸化。這些結(jié)果表明Ser467是Akt

22、磷酸化TFEB的位點(diǎn)。
　　3.Ser467是Akt磷酸化TFEB的特異性位點(diǎn)
　　為了進(jìn)一步證實(shí)Ser467是Akt磷酸化TFEB的位點(diǎn)，我們制備了特異性的抗 TFEB-S467磷酸化抗體，用其檢測(cè)Akt激活劑或者抑制劑對(duì)TFEB-S467磷酸化的影響。免疫沉淀結(jié)果顯示，給予insulin刺激時(shí)，S467A突變體不能被Akt磷酸化，并且不受Akt-Ser473被insulin磷酸化的影響。同樣，用Akt inhibitor

23、處理穩(wěn)定表達(dá)Flag-TFEB或TFEB-S467A的細(xì)胞株時(shí)，TFEB-Ser467和Akt-Ser473的磷酸化都會(huì)受到抑制。另外，分別用過(guò)Wortmannin、Akt inhibitor和ERK抑制劑 PD98059預(yù)處理細(xì)胞后給予insulin刺激，結(jié)果顯示，Insulin可以顯著增強(qiáng) TFEB-Ser467磷酸化，但在PI3K/Akt抑制劑處理的細(xì)胞中不能上調(diào)TFEB-Ser467磷酸化水平。體外激酶活性分析也證明突變體TFE

24、B-S467A不能被Akt磷酸化。綜上所述，TFEB被Akt磷酸化的位點(diǎn)是Ser467。
　　小結(jié):
　　1.Akt磷酸化TFEB。
　　2.Akt磷酸化TFEB的Ser467位點(diǎn)。
　　第三部分：Akt通過(guò)磷酸化TFEB而抑制過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡
　　目的：探討Akt信號(hào)通路抑制過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。
　　方法：
　　1.Western blot檢測(cè) SH-SHY5Y或神

25、經(jīng)元細(xì)胞被重組慢病毒TFEB、TFEB-S467A以及TFEB-S467D感染后，過(guò)氧化氫、Akt抑制劑、EGF對(duì)PARP活化的影響。
　　2.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SH-SHY5Y或神經(jīng)元細(xì)胞被重組慢病毒TFEB、TFEB-S467A以及TFEB-S467D感染后，過(guò)氧化氫、Akt抑制劑、EGF對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。
　　3.小鼠中腦注射重組腺病毒GFP、TFEB、TFEB-S467A以及TFEB-S467D后，免疫組化染色觀察MPT

26、P對(duì)小鼠中腦神經(jīng)元凋亡的影響。
　　結(jié)果：
　　1.Akt誘導(dǎo)的TFEB磷酸化抑制過(guò)氧化氫引起的SH-SHY5Y細(xì)胞凋亡首先，我們用野生型的TFEB、TFEB-S467A以及TFEB-S467D（相當(dāng)于持續(xù)活化的TFEB）感染SH-SHY5Y細(xì)胞，檢查過(guò)氧化氫對(duì)PARP活化的影響。Western blot結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)TFEB和TFEB-S467D可以顯著減少過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的PARP活化，而TFEB-S467A對(duì)PARP活化

27、沒(méi)有影響。為了進(jìn)一步證實(shí) TFEB抑制細(xì)胞凋亡依賴于Akt信號(hào)通路，用 Akt抑制劑或激活劑預(yù)處理過(guò)表達(dá) TFEB、TFEB-S467A、TFEB-S467D的SH-SHY5Y細(xì)胞后，再給予過(guò)氧化氫刺激。Western blot結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)TFEB-S467D的細(xì)胞與TFEB-S467A細(xì)胞相比，過(guò)氧化氫或Akt抑制劑引起的PARP活化顯著減少；用 EGF激活A(yù)kt信號(hào)通路后，過(guò)表達(dá)TFEB-S467A的細(xì)胞與過(guò)表達(dá)野生型TFEB和

28、TFEB-S467D的細(xì)胞相比，過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的PARP活化并沒(méi)有明顯減少。
　　另外，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)TFEB和TFEB-S467D可以顯著抑制由過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，而S467A突變體失去了這種抑制作用。無(wú)論單獨(dú)給予過(guò)氧化氫還是用過(guò)氧化氫和Akt inhibitor共同處理細(xì)胞，過(guò)表達(dá) TFEB-S467D均可以減少 SH-SHY5Y細(xì)胞凋亡。然而用 EGF激活A(yù)kt后，過(guò)表達(dá)TFEB-S467A不能抑制過(guò)氧化氫誘導(dǎo)

29、的SH-SHY5Y細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果表明，Akt誘導(dǎo)的TFEB-S467磷酸化是阻抑過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的SH-SHY5Y細(xì)胞凋亡所必須的。
　　2.Akt誘導(dǎo)的TFEB抑制過(guò)氧化氫引起的原代神經(jīng)元凋亡同時(shí)，我們也檢測(cè)了TFEB-S467磷酸化對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的原代神經(jīng)元凋亡的影響。用TFEB、TFEB-S467A、TFEB-S467D感染小鼠原代神經(jīng)元細(xì)胞后，再用Akt inhibitor和過(guò)氧化氫處理細(xì)胞。Western blot結(jié)果顯

30、示，過(guò)表達(dá) TFEB-S467D的細(xì)胞與過(guò)表達(dá) TFEB-S467A的細(xì)胞相比，無(wú)論單獨(dú)給予過(guò)氧化氫還是用過(guò)氧化氫和Akt inhibitor共同處理細(xì)胞，PARP的活化均受到顯著抑制。與Western blot結(jié)果一致，流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果也顯示，過(guò)表達(dá)TFEB-S467D可以顯著抑制由過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的原代神經(jīng)元凋亡。這些結(jié)果顯示，Akt催化的TFEB-Ser467位點(diǎn)磷酸化對(duì)阻抑過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的原代神經(jīng)元凋亡是必要的。
　　3.磷酸

31、化型TFEB可以保護(hù)多巴胺神經(jīng)元免受MPTP的損傷
　　已經(jīng)證明，MPTP通過(guò)誘導(dǎo)腦組織氧化應(yīng)激而損傷多巴胺神經(jīng)元并導(dǎo)致帕金森癥。為了進(jìn)一步探討TFEB-Ser467磷酸化是否可以保護(hù)多巴胺神經(jīng)元，我們給小鼠中腦注射TFEB、TFEB-S467A、TFEB-S467D腺病毒，使其在腦組織過(guò)表達(dá)后，觀察TFEB-Ser467磷酸化對(duì)MPTP誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡中的影響。酪氨酸羥化酶的免疫熒光染色結(jié)果顯示，與未注射的區(qū)域相比，過(guò)表達(dá)TFE

32、B和TFEB-S467D可以顯著增加酪氨酸羥化酶陽(yáng)性神經(jīng)元細(xì)胞的數(shù)量，說(shuō)明細(xì)胞存活率增加。這些結(jié)果表明，在 MPTP誘導(dǎo)的小鼠中腦多巴胺神經(jīng)元損傷模型中，TFEB-Ser467位點(diǎn)磷酸化可以保護(hù)由MPTP誘導(dǎo)的多巴胺神經(jīng)元損傷。
　　小結(jié):
　　1.Akt誘導(dǎo)的TFEB磷酸化抑制過(guò)氧化氫引起的SH-SHY5Y細(xì)胞和原代神經(jīng)元凋亡。
　　2.磷酸化型TFEB可以保護(hù)多巴胺神經(jīng)元免受MPTP的損傷。
　　結(jié)論：