雷公藤紅素抑制鎘誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞JNK通路激活抗凋亡分子機(jī)理研究.pdf

1、本研究采用細(xì)胞培養(yǎng)、TUNEL和DAPI染色、Western blotting、ROS熒光染色及成像等細(xì)胞分子生物學(xué)技術(shù)和方法，以PC12細(xì)胞和小鼠原代神經(jīng)細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，綜合研究了雷公藤紅素干預(yù)鎘誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞PP2A-JNK通路抗凋亡，雷公藤紅素抵抗鎘失活PP5依賴的JNK通路激活抗凋亡，以及雷公藤紅素靶向NOX2-ROS介導(dǎo)PP5-JNK通路改善鎘誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡分子機(jī)理。結(jié)果如下:
　　1 雷公藤紅素干預(yù)鎘誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞PP2

2、A-JNK通路抗凋亡
　　PC12細(xì)胞和小鼠原代神經(jīng)元用雷公藤紅素（0-1μM）預(yù)處理1h后暴露鎘（10μM）4h、或用PP2A抑制劑Okadaic acid(OA，100nM)預(yù)處理1h后再用雷公藤紅素（1μM）預(yù)處理1h接著暴露鎘(10μM)4h或24h。另用Ad-dn-PP2A、Ad-PP2A-wt或Ad-GFP（作為對(duì)照）感染的PC12細(xì)胞用JNK抑制劑SP600125(20μM)預(yù)處理1h后再用雷公藤紅素（1μM）預(yù)處理

3、1h接著暴露鎘(10μM)4h或24h。DAPI染色評(píng)估細(xì)胞凋亡表現(xiàn)，Western blot分析相關(guān)蛋白表達(dá)變化。結(jié)果顯示:雷公藤紅素明顯減弱鎘抑制的PP2A活性以及鎘激活的JNK通路;PP2A抑制劑OA抵抗雷公藤紅素抑制鎘誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞磷酸化PP2A、去甲基PP2A和磷酸化JNK以及凋亡;SP600125強(qiáng)化雷公藤紅素抑制鎘誘導(dǎo)JNK通路激活和凋亡;異位表達(dá)純化PP2A削弱雷公藤紅素抑制鎘誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞JNK通路激活和凋亡，而過表達(dá)P

4、P2A加強(qiáng)雷公藤紅素抑制這些事件。提示:雷公藤紅素干預(yù)鎘誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞PP2A-JNK通路抗凋亡。
　　2 雷公藤紅素抵抗鎘失活PP5依賴的JNK通路激活抗鎘誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡
　　PC12細(xì)胞和小鼠原代神經(jīng)元用雷公藤紅素（1μM）預(yù)處理1h后暴露鎘(10和20μM)12h。另用Ad-PP5或Ad-dn-c-Jun感染的PC12細(xì)胞在雷公藤紅素(1μM)、JNK抑制劑SP600125（20μM）或Caspase抑制劑zVAD-f

5、mk(100μM)預(yù)處理1h后暴露鎘（10μM）12h或24h。然后，采用MTS分析細(xì)胞活性、TUNEL染色評(píng)估細(xì)胞凋亡、Western blot分析相關(guān)信號(hào)蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示:雷公藤紅素明顯改善鎘導(dǎo)致的PP5失活;過表達(dá)PP5部分地增強(qiáng)雷公藤紅素抑制鎘誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞JNK激活和凋亡;異位表達(dá)鈍化c-Jun加強(qiáng)雷公藤紅素抑制鎘誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞JNK激活和凋亡。提示:雷公藤紅素抵抗鎘失活PP5依賴的JNK通路激活抗鎘誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

6、　　3 雷公藤紅素靶向NOX2-ROS介導(dǎo)PP5-JNK通路改善鎘誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡
　　PC12細(xì)胞和小鼠原代神經(jīng)元用雷公藤紅素（1μM）預(yù)處理1h、或用NOXs抑制劑Apocynin（0-100μM）預(yù)處理1h、或用NAC(5mM)或Apocynin(50μM)預(yù)處理1h后再用雷公藤紅素（1μM）預(yù)處理1h，接著暴露鎘（10和/或20μM)12h或24h。選用ROS熒光探針CM-H2DCFDA標(biāo)記檢測(cè)熒光強(qiáng)度或成像分析ROS表現(xiàn)

7、、TUNEL染色評(píng)估細(xì)胞凋亡，檢測(cè)Caspase-3/7活性，Western blot分析相關(guān)蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示:雷公藤紅素明顯抑制鎘誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞ROS產(chǎn)生;ROS清除劑NAC削弱鎘誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞ROS和凋亡，且強(qiáng)化雷公藤紅素活性抑制作用;NAC增強(qiáng)雷公藤紅素阻滯鎘上調(diào)神經(jīng)細(xì)胞NXO2依賴的ROS產(chǎn)生;Apocynin以濃度依賴方式抑制鎘誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞NOX2和ROS產(chǎn)生，且提高雷公藤紅素抑制鎘誘導(dǎo)的這些事件;Apocynin強(qiáng)化雷公藤紅素