雷公藤紅素抑制AR誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞自噬的分子機制研究.pdf

1、前列腺癌是一種威脅男性健康的重大疾病，雄激素受體（Androgen Receptor，AR）信號通路在前列腺癌的發(fā)生與演進過程中發(fā)揮重要作用，因此，臨床上通過手術(shù)或藥物抑制AR信號通路是治療早期前列腺癌的標(biāo)準(zhǔn)方法。但是雄激素剝奪只能在一段時間內(nèi)延長患者的生存期，多數(shù)患者會在2年內(nèi)發(fā)生癌癥復(fù)發(fā)，發(fā)展為浸潤性更強的去勢抵抗性前列腺癌（Castration Resistant ProstateCancer，CRPC）。目前的研究結(jié)果顯示，去勢

2、抵抗的形成來源于 AR信號通路被重新激活?；诖耍呀?jīng)有多種新型阻斷AR信號通路的藥物用于臨床。雷公藤紅素是從傳統(tǒng)中藥雷公藤根部分離的三萜烯類化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)與第三代AR信號通路阻斷劑TOK-001相似，作用于AR降解途徑，對CRPC的治療具有潛在的應(yīng)用效果。
　　研究表明，抑制AR信號通路誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。本研究首先分析了雷公藤紅素抑制AR信號通路對細(xì)胞自噬的誘導(dǎo)。qPCR顯示雷公藤紅素誘導(dǎo)ATG5和ATG7基因表達上調(diào)；共聚焦顯

3、微鏡觀察發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素作用后自噬體與自噬斑數(shù)量增多；免疫印跡結(jié)果顯示雷公藤紅素處理后自噬標(biāo)志物L(fēng)C3-II/LC3-I比值升高，且自噬體受體蛋白p62表達降低，表明雷公藤紅素誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的發(fā)生，并促進自噬潮的進行。在雷公藤紅素誘導(dǎo)細(xì)胞自噬過程中，伴隨著AR蛋白的降低，提示AR負(fù)調(diào)控雷公藤紅素誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬。為進一步探究AR和雷公藤紅素誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬的關(guān)系，本研究通過RNAi技術(shù)沉默AR，結(jié)果顯示AR沉默后細(xì)胞自噬水平升高；相反，過表達A

4、R或通過R1881激活內(nèi)源性AR則抑制基礎(chǔ)水平以及雷公藤紅素誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬。這些結(jié)果表明，AR負(fù)調(diào)控雷公藤紅素誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬。抑制AR信號通路將誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而凋亡間接地誘導(dǎo)自噬的發(fā)生。為分析凋亡的間接影響，利用雄激素阻斷劑MDV3100抑制AR信號通路，證實在未發(fā)生凋亡的條件下，AR與自噬呈負(fù)相關(guān)。同樣，雷公藤紅素在不影響凋亡的條件下降低AR，導(dǎo)致細(xì)胞自噬。通過抑制劑處理進一步發(fā)現(xiàn)，凋亡被抑制不影響雷公藤紅素誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬；而自噬被抑

5、制則促進細(xì)胞凋亡。
　　AR作為轉(zhuǎn)錄因子既可以調(diào)控功能基因的轉(zhuǎn)錄，也可以調(diào)控非編碼基因的轉(zhuǎn)錄。通過miRNA表達譜分析發(fā)現(xiàn)，雷公藤紅素誘導(dǎo)自噬過程中miR-101以及miR-17-92a基因簇的表達顯著下調(diào)，該結(jié)果通過qPCR得以驗證。鑒于miR-101以及miR-17-92a基因簇的啟動子區(qū)可以預(yù)測雄激素反應(yīng)元件（ARE），推測AR轉(zhuǎn)錄激活這兩個miRNAs抑制自噬。通過雙熒光素酶報告基因分析以及染色質(zhì)免疫沉淀證明AR能夠與mi

6、R-101和miR-17-92a基因簇預(yù)測的ARE結(jié)合。在前列腺癌細(xì)胞系，miR-101和miR-17-92a基因簇的表達與AR表達水平呈正相關(guān)。在AR陽性細(xì)胞沉默AR基因造成miR-101和miR-17-92a基因簇的表達下調(diào)；在AR陰性細(xì)胞過表達AR基因造成二者表達上調(diào)。這些結(jié)果進一步證實AR轉(zhuǎn)錄激活miR-101和miR-17-92a基因簇。
　　miR-101為自噬抑制劑。雷公藤紅素降低AR，解除了其對自噬的抑制，但轉(zhuǎn)染m

7、iR-101類似物可以彌補AR對自噬的抑制作用；過表達AR增強對自噬的抑制，但miR-101抑制劑共轉(zhuǎn)染可以逆轉(zhuǎn)AR高表達對自噬的抑制效應(yīng)，表明miR-101是AR抑制雷公藤紅素誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬的一個效應(yīng)分子。
　　miR-17-92a基因簇與細(xì)胞自噬的調(diào)控關(guān)系未見報道，本研究通過蛋白免疫印跡實驗和共聚焦顯微鏡觀察，確認(rèn)miR-17-92a基因簇抑制基礎(chǔ)水平以及雷公藤紅素誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬。通過構(gòu)建miR-17-92a基因簇的截短體，解

8、析miR-17-92a基因簇成員分子與細(xì)胞自噬的關(guān)系，結(jié)果顯示在基因簇中miR-17和miR-20a能夠抑制基礎(chǔ)水平以及雷公藤紅素誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬；而miR-18a則激活雷公藤紅素誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬。通過雙熒光素酶報告實驗、qPCR以及免疫印跡雜交對miR-17和miR-20a靶基因進行驗證，確認(rèn)ATG7是miR-17和miR-20a的下游調(diào)控基因。通過轉(zhuǎn)染缺少ATG7的表達載體進行細(xì)胞自噬恢復(fù)實驗，結(jié)果進一步明確miR-17和miR-20a

9、通過調(diào)控ATG7抑制雷公藤紅素誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬。
　　為了明確雷公藤紅素誘導(dǎo)自噬在前列腺癌中的作用，本研究進行了MTT以及克隆形成實驗，結(jié)果顯示細(xì)胞自噬被 miR-101、miR-17、miR-20a以及巴弗洛霉素抑制后，活細(xì)胞數(shù)以及細(xì)胞的克隆形成能力均下降，表明雷公藤紅素誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬對前列腺癌細(xì)胞的存活具有保護效應(yīng)。
　　綜上所述，本研究揭示了AR對細(xì)胞自噬的負(fù)調(diào)控作用，闡明了雷公藤紅素通過抑制AR，降低自噬抑制因子miR