丙戊酸誘導(dǎo)前列腺癌PC-3細(xì)胞自噬及其機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　 前列腺癌是美國(guó)最常見(jiàn)的腫瘤，在癌癥引起的死亡中位居第二位。在前列腺癌的發(fā)病率一直較低的國(guó)家如中國(guó)，其發(fā)病率也呈快速上升趨勢(shì)。該病一旦診斷，其主要的治療方法為手術(shù)切除和放射治療，但這兩種方法對(duì)于晚期前列腺癌的治療效果均不佳，因此其長(zhǎng)期生存率也是很低的。近年來(lái)，越來(lái)越多的文獻(xiàn)報(bào)道，組蛋白去乙?；敢种苿?Histone deacetylase inhibitor,HDACI)可在體內(nèi)外抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)分化和

2、凋亡。丙戊酸(Valproic acid，VPA)作為HDACI類(lèi)藥物，可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制、分化和凋亡，但關(guān)于VPA誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡的文獻(xiàn)報(bào)道較少，在本項(xiàng)研究中，我們擬就VPA誘導(dǎo)前列腺癌PC-3細(xì)胞系發(fā)生自噬性死亡的過(guò)程進(jìn)行觀察，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步探討，為臨床開(kāi)發(fā)治療前列腺癌的新藥物提供理論依據(jù)及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 目的：
　　 對(duì)VPA誘導(dǎo)前列腺癌PC-3細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡的過(guò)程在體外進(jìn)行觀察和

3、檢測(cè)，并初步探索自噬與Akt/mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)系，為深入研究VPA抑制前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用機(jī)制提供進(jìn)一步理論依據(jù)。
　　 材料與方法：
　　 將人前列腺癌PC-3細(xì)胞接種于96孔板中，5％CO2、37℃恒溫培養(yǎng)，應(yīng)用5.0mmol/L VPA進(jìn)行干預(yù)，并設(shè)立對(duì)照組，作用24h、48h、96h后行CCK-8染色法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況。本實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和VPA5.0mmol/L組。于細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期加入藥物VPA，分別培

4、養(yǎng)24h、48h及72h，收集制備標(biāo)本后行透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)(包括自噬體和自噬溶酶體)。PC-3細(xì)胞接種于蓋玻片置于6孔板中，分組及培養(yǎng)時(shí)間同上，常規(guī)收集、固定細(xì)胞，加入一抗及帶FITC熒光標(biāo)記的二抗制片，應(yīng)用免疫熒光測(cè)定儀觀察細(xì)胞內(nèi)熒光的數(shù)量及強(qiáng)度。常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)，分組及藥物作用濃度和時(shí)間同上，應(yīng)用Western-blotting檢測(cè)經(jīng)VPA處理后PC-3細(xì)胞內(nèi)LC3-11、p-Akt蛋白的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：<

5、br>　　 經(jīng)VPA處理后，人前列腺癌PC-3細(xì)胞系細(xì)胞增殖活性實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組短期內(nèi)差別不大，無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。透射電子顯微鏡觀察可見(jiàn)人前列腺癌PC-3細(xì)胞系細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有大量自噬體和自噬溶酶體，實(shí)驗(yàn)組自噬體的數(shù)量較對(duì)照組明顯增多，且隨VPA作用時(shí)間的延長(zhǎng)自噬的水平逐漸增強(qiáng)，證明了VPA誘導(dǎo)人前列腺癌PC-3細(xì)胞自噬性死亡的存在。經(jīng)綠色熒光FITC標(biāo)記的自噬特異性蛋白LC3-Ⅱ可以清楚顯示自噬在細(xì)胞中的分布，即可見(jiàn)LC3綠

6、色熒光呈點(diǎn)狀散在分布于細(xì)胞膜附近，而陰性對(duì)照組只有極弱的熒光。隨VPA作用時(shí)間的延長(zhǎng)，人前列腺癌PC-3細(xì)胞系細(xì)胞自噬特異性相關(guān)蛋白LC3-11表達(dá)水平明顯升高，而p-Akt蛋白的表達(dá)水平則明顯降低，變化趨勢(shì)顯著，有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 VPA作用人前列腺癌PC-3細(xì)胞4天，可誘導(dǎo)前列腺癌PC-3細(xì)胞發(fā)生自噬，其自噬的程度與藥物作用的時(shí)間呈正相關(guān)，其誘導(dǎo)列腺癌PC-3細(xì)胞發(fā)生自噬的機(jī)制與阻