辛伐他汀對(duì)人前列腺癌細(xì)胞PC-3的體外作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：探討辛伐他汀(Simvastatin)對(duì)人前列腺癌細(xì)胞PC-3的體外作用及其相關(guān)機(jī)制，同時(shí)觀察辛伐他汀聯(lián)合抗癌藥物紫杉醇(Paclitaxel)、順鉑(Cisplatin)對(duì)PC-3細(xì)胞的體外作用。 方法：1將人前列腺癌細(xì)胞PC-3進(jìn)行體外培養(yǎng)，采用四甲基偶氮唑藍(lán)(tetrzolium-basedcolorimetricassay,MTT)比色法檢測(cè)辛伐他汀對(duì)該細(xì)胞增殖的影響，測(cè)定吸光度(OD)值。流式細(xì)胞儀測(cè)定辛伐他汀對(duì)

2、PC-3細(xì)胞周期分布和凋亡的影響，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，通過(guò)DNA凝膠電泳進(jìn)行DNA片斷化分析，流式細(xì)胞儀間接免疫熒光技術(shù)分析辛伐他汀作用后PC-3細(xì)胞p21Ras、E2F-1、CDK4、Bax蛋白表達(dá)的變化。2采用MTT比色法檢測(cè)辛伐他汀與抗癌藥物紫杉醇、順鉑聯(lián)合應(yīng)用后對(duì)人前列腺癌細(xì)胞PC-3的增殖抑制作用，測(cè)定其吸光度(OD)值，并采用isobolanalysis公式分析相互作用指數(shù)(IteractionIndex)，評(píng)價(jià)

3、聯(lián)合后的作用。如相互作用指數(shù)＞1為兩藥拮抗作用；相互作用指數(shù)=1為兩藥相加作用；相互作用指數(shù)＜1為兩藥協(xié)同作用。 結(jié)果：1MTT比色法顯示辛伐他汀(1、5、10、15、20、25、50μmol/L)對(duì)PC-3細(xì)胞具有抑制增殖的作用。不同濃度辛伐他汀處理細(xì)胞24～96h后，與對(duì)照組相比，各處理組OD值均有不同程度下降，差異具有顯著性(P＜0.05)。且隨辛伐他汀處理濃度的增大、作用時(shí)間的延長(zhǎng)，OD值逐漸下降，即辛伐他汀對(duì)PC-3細(xì)

4、胞的增殖抑制作用有明顯的劑量—效應(yīng)和時(shí)間—效應(yīng)依賴(lài)關(guān)系。辛伐他汀處理細(xì)胞48、72、96h，IC50分別為17.13μmol/L、5.56μmol/L、3.24μmol/L。辛伐他汀作用PC-3細(xì)胞后，有明顯的細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變：PC-3細(xì)胞縮小呈紡錘狀，兩端各有一細(xì)長(zhǎng)的偽足。隨辛伐他汀濃度增大和作用時(shí)間延長(zhǎng)，這種變化逐漸明顯，PC-3細(xì)胞漸變圓，貼壁細(xì)胞減少，脫落細(xì)胞增多。同時(shí)可見(jiàn)到細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變：細(xì)胞皺縮、破裂呈不規(guī)則形，在細(xì)胞周

5、圍有放射狀分布的點(diǎn)片狀細(xì)胞碎片，有的細(xì)胞胞漿中出現(xiàn)空泡。隨藥物濃度增加和作用時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞破碎增多，培養(yǎng)液中可見(jiàn)到大量細(xì)胞碎片。DNA凝膠電泳顯示5、10、20μmol/L辛伐他汀處理PC-3細(xì)胞48h后，出現(xiàn)典型的階梯狀排列的DNA梯帶，而對(duì)照組則無(wú)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)PC-3細(xì)胞周期分布和凋亡顯示，0、5、10、20μmol/L辛伐他汀作用PC-3細(xì)胞48h后，隨藥物濃度增大，G0/G1期細(xì)胞逐漸增多；S期和G2/M期細(xì)胞則逐漸減少。即

6、辛伐他汀可阻滯PC-3細(xì)胞周期進(jìn)程于G1期，該作用呈劑量—效應(yīng)依賴(lài)關(guān)系。0、5、10、20μmol/L辛伐他汀處理細(xì)胞48h后，出現(xiàn)典型的亞二倍體凋亡峰，依辛伐他汀濃度增大而逐漸升高；凋亡百分率分別為：1.06％、6.24％、12.46％、17.21％。流式細(xì)胞儀間接分析細(xì)胞p21Ras、E2F-1、CDK4、Bax的蛋白表達(dá)顯示，0、5、10、20μmol/L辛伐他汀處理PC-3細(xì)胞48h后，p21Ras、E2F-1、CDK4的熒光指

7、數(shù)FI值隨處理濃度增大而逐漸減??；Bax的FI值則隨處理濃度增大而逐漸增大。對(duì)于每一種蛋白，比較其處理組和對(duì)照組的FI值，差異具有顯著性(P＜0.05)。2MTT比色法分析辛伐他汀聯(lián)合紫杉醇、順鉑對(duì)PC-3細(xì)胞的增殖抑制作用，結(jié)果顯示：≥2μmol/L的辛伐他汀可加強(qiáng)紫杉醇對(duì)PC-3細(xì)胞的增殖抑制作用。在2～10μmol/L范圍內(nèi)，隨辛伐他汀濃度的增大，其對(duì)紫杉醇的協(xié)同作用增強(qiáng)。單用紫杉醇的IC50為10-6.13mol/L，聯(lián)合2μm

8、ol/L辛伐他汀后可將紫杉醇的IC50降低至10-6.40mol/L；聯(lián)合5μmol/L辛伐他汀后可將紫杉醇的IC50降低至10-6.61mol/L；聯(lián)合10μmol/L辛伐他汀后可將紫杉醇的IC50降低至10-7.40mol/L。因此，在一定濃度范圍內(nèi)，辛伐他汀可協(xié)同紫杉醇抑制PC-3細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖。在2～10μmol/L范圍內(nèi)，辛伐他汀可協(xié)同順鉑抑制PC-3細(xì)胞生長(zhǎng)增殖，且隨藥物濃度增大，這種協(xié)同作用增強(qiáng)。單用順鉑的IC50為1.4

9、4μg/ml，聯(lián)合2μmol/L辛伐他汀后可將順鉑的IC50降低至1.15μg/ml；聯(lián)合5μmol/L辛伐他汀后可將順泊的IC50降低至0.92μg/ml；聯(lián)合10μmol/L辛伐他汀后可將順鉑的IC50降低至0.52μg/ml。因此，辛伐他汀可加強(qiáng)順鉑對(duì)PC-3細(xì)胞的增殖抑制作用。3Isobolanalysis分析相互作用指數(shù)顯示，辛伐他汀聯(lián)合紫杉醇、順鉑在細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率為50％時(shí)的相互作用指數(shù)均小于1，證明辛伐他汀確實(shí)可協(xié)同紫杉醇

10、、順鉑對(duì)PC-3細(xì)胞的增殖抑制作用；辛伐他汀聯(lián)合紫杉醇的相互作用指數(shù)小于辛伐他汀聯(lián)合順鉑的相互作用指數(shù)，說(shuō)明辛伐他汀對(duì)紫杉醇的協(xié)同作用大于其對(duì)順鉑的協(xié)同作用。 結(jié)論：1本研究首次通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了HMG-CoA還原酶抑制劑辛伐他汀具有抗激素非依賴(lài)性前列腺癌細(xì)胞PC-3的作用，為激素非依賴(lài)性前列腺癌的治療提供了新的理論依據(jù)。2本實(shí)驗(yàn)證實(shí)辛伐他汀具有抑制前列腺癌細(xì)胞PC-3增殖的作用，且此作用呈時(shí)間—?jiǎng)┝恳蕾?lài)關(guān)系。3本實(shí)驗(yàn)證實(shí)辛伐他

11、汀可阻滯前列腺癌細(xì)胞PC-3于G1期并可誘導(dǎo)該細(xì)胞凋亡。4我們初步推論辛伐他汀通過(guò)下調(diào)p21Ras、E2F-1、CDK4蛋白的表達(dá)和上調(diào)Bax蛋白的表達(dá)而發(fā)揮其抑制前列腺癌細(xì)胞PC-3增殖、誘導(dǎo)該細(xì)胞凋亡的作用。5本實(shí)驗(yàn)證實(shí)辛伐他汀可協(xié)同紫杉醇、順鉑對(duì)PC-3細(xì)胞的增殖抑制作用；辛伐他汀對(duì)紫杉醇的協(xié)同抗瘤作用大于其對(duì)順鉑的協(xié)同抗瘤作用。6本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了辛伐他汀這一臨床常用的降脂藥物具有抗前列腺癌的作用，并通過(guò)辛伐他汀聯(lián)合兩種化療藥物的研究