dsRNA上調(diào)Numb基因表達(dá)對人前列腺癌PC-3細(xì)胞影響的研究.pdf

1、目的：
　　基于小激活RNA（small activating RNA，saRNA）的腫瘤治療策略，為Numb基因篩選出具有激活功能并相對高效的saRNA分子。繼而探討雄激素及抗雄激素藥物對轉(zhuǎn)染Numb-saRNA的人前列腺癌PC-3細(xì)胞生長的影響。
　　方法：
　　1.設(shè)計與合成針對Numb基因的3對候選小分子雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）分子，對照組 dsRNA（dsControl

2、）設(shè)計成與人類基因組序列非同源。將dsRNA分子轉(zhuǎn)染人前列腺癌PC-3細(xì)胞。
　　2.采用Real-time quantitativePCR(RT-qPCR)法檢測轉(zhuǎn)染后人前列腺癌PC-3細(xì)胞中靶基因Numb的mRNA表達(dá)水平。
　　3.Western Blot驗證轉(zhuǎn)染后人前列腺癌PC-3細(xì)胞靶基因Numb的蛋白表達(dá)水平。
　　4.將篩選出的Numb-saRNA轉(zhuǎn)染入人前列腺癌PC-3細(xì)胞，實驗組分為轉(zhuǎn)染組和非轉(zhuǎn)染組，

3、以未轉(zhuǎn)染以及未行藥物處理的細(xì)胞作為陰性對照組。分別采用不同濃度的二氫睪酮(dihydrotestosterone,DHT)，氟他胺(flutamide)、二氫睪酮-氟他胺混合液(dihydrotestosterone-flutamide mixture,DHT-F)處理實驗組細(xì)胞，采用MTT法在藥物處理48h后分別測定細(xì)胞活性；
　　5.根據(jù)MTT法檢測結(jié)果，篩選出有效的藥物濃度，分別處理轉(zhuǎn)染組和非轉(zhuǎn)染細(xì)胞，培養(yǎng)48h后，采用An

4、nexin V-FITC/PI檢測各組細(xì)胞的凋亡情況。
　　結(jié)果：
　　1.dsNumb-870、dsNumb-948均未能上調(diào)人前列腺癌PC-3細(xì)胞中靶基因Numb mRNA水平；而dsNumb-298能上調(diào)細(xì)胞內(nèi)Numb mRNA和蛋白水平。
　　2.采用MTT法檢測細(xì)胞增殖情況，DHT處理細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染組在10-3mol/L、10-4mol/L、10-5mol/L三個濃度組的相對存活率均明顯低于陰性對照組，差異

5、有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；轉(zhuǎn)染組在10-3mol/L和10-4mol/L濃度組的相對存活率明顯低于非轉(zhuǎn)染組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。氟他胺處理細(xì)胞后，轉(zhuǎn)染組在10-3mol/L、10-4mol/L、10-5mol/L三個濃度組的相對存活率均低于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；轉(zhuǎn)染組在10-4mol/L濃度組的相對存活率明顯低于非轉(zhuǎn)染組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。二氫睪酮-氟他胺混合液處理后,轉(zhuǎn)染組各個

6、濃度組的相對存活率較陰性對照組均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；且轉(zhuǎn)染組在各個濃度的相對存活率均明顯低于非轉(zhuǎn)染組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3.采用Annexin V-FITC/PI雙染法，利用流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況，DHT處理后，轉(zhuǎn)染組的凋亡率較陰性對照組下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；轉(zhuǎn)染組的凋亡率較非轉(zhuǎn)染組明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。氟他胺處理后，轉(zhuǎn)染組的凋亡率較陰性

7、對照組明顯上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；轉(zhuǎn)染組較非轉(zhuǎn)染組的凋亡率明顯上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。二氫睪酮-氟他胺混合液處理后，轉(zhuǎn)染組的凋亡率較陰性對照組明顯上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；轉(zhuǎn)染組的凋亡率多于非轉(zhuǎn)染組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.經(jīng)篩選dsNumb-298具有特異性激活人前列腺癌PC-3細(xì)胞中Numb基因表達(dá)的功能。
　　2.將Numb-saRNA