轉(zhuǎn)染抑癌基因KLF6對前列腺癌PC-3細(xì)胞作用的實驗研究.pdf

1、近來發(fā)現(xiàn)野生型抑癌基因KLF6在前列腺癌中的突變率高達(dá)77％，且有高度特異性。本研究克隆了野生型KLF6基因，將其重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入前列腺癌PC-3細(xì)胞，觀察了KLF6對PC-3細(xì)胞生長增殖、細(xì)胞周期、對Bcl-2和CyclinD1蛋白表達(dá)的影響等，分四個部分簡述如下。 第一部分：抑癌基因KLF6的克隆及質(zhì)粒的構(gòu)建【目的】從正常人體中提取總RNA，利用RT-PCR法反應(yīng)獲得目的基因野生型KLF6的cDNA片斷，構(gòu)建具備可進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染

2、和容易被識別篩選的KLF6-pEGFP-C1質(zhì)粒載體。 【材料和方法】應(yīng)用Trizol法從人體正常肝臟細(xì)胞中提取mRNA，按GeneBank公布的野生型KLF6基因序列及文獻(xiàn)設(shè)計引物序列：5’端引物：5’-AAGGTACCATGGACGTGCTCCCTATGTGC-3’;3’端引物：5’-CGTCTAGATCAGAGGTGCCTCTTCATGTG-3’。RT-PCR反應(yīng)在94℃1min,60℃1.5min，72℃2min，最后在

3、72℃延伸8min條件下進(jìn)行30個循環(huán)，獲得852bp大小的野生型KLF6的cDNA片段pKLF6。pKLF6用內(nèi)切酶BamHI和EcoRI雙酶切，真核表達(dá)載體pEGFP-C1同樣用BamHI和EcoRI雙酶切，二者進(jìn)行連接反應(yīng)，構(gòu)建包含目的基因KLF6的重組質(zhì)粒pEGFP-C1-KLF6。 【結(jié)果】使用Trizol法分離和提取得到正常人體的總RNA，通過RT-PCR法反應(yīng)獲得目的基因野生型、KLF6的cDNA片斷，構(gòu)建完成了能

4、夠穩(wěn)定表達(dá)和具有篩選特征的KLF6-pEGFP-C1質(zhì)粒載體，使其成為可進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染和易被識別的穿梭質(zhì)粒，供后續(xù)轉(zhuǎn)染和表達(dá)實驗使用。 【結(jié)論】Trizol法簡便快速地提取到正常人體的總RNA，RT-PCR法反應(yīng)準(zhǔn)確地獲得目的基因野生型KLF6的cDNA片斷，正確構(gòu)建完成的KLF6-pEGFP-C1質(zhì)粒載體，具備進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染和易被識別和篩選的特點。 第二部分：脂質(zhì)體介導(dǎo)重組KLF6質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染和PC-3細(xì)胞的培養(yǎng)篩選【目的】

5、對重組KLF6-pEGFP-C1質(zhì)粒載體進(jìn)行擴(kuò)增，以達(dá)到實驗所需要的數(shù)量并進(jìn)行純化。將重組KLF6-pEGFP-C1質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染入雄激素非依賴性前列腺癌PC-3細(xì)胞中，篩選出陽性細(xì)胞克隆。 【材料和方法】制備感受態(tài)細(xì)菌E.coliDH5a，加入含KLF6的重組pEGFP-C1質(zhì)粒DNA溶液，加入LB液體培養(yǎng)基中37℃振蕩培養(yǎng)1小時，取100μl接種于含Amp的篩選平板上，37℃培養(yǎng)出現(xiàn)明顯而又未相互重疊的單菌落，收獲并以堿裂解法

6、抽提質(zhì)粒DNA并純化，用限制性內(nèi)切酶KpnI和XbaI酶切，電泳檢驗。在37℃含5％CO2的條件下，含10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中進(jìn)行PC-3細(xì)胞的傳代培養(yǎng)。采用脂質(zhì)體LipofectAMINE2000介導(dǎo)質(zhì)粒pEGFP-C1-KLF6在PC-3細(xì)胞處于對數(shù)生長期時進(jìn)行轉(zhuǎn)染，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/ml，按每孔1×106細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板。配制脂質(zhì)體和pEGFP-C1-KLF6的混合物，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中轉(zhuǎn)染1小時，再置

7、換含10％小牛血清的完全培養(yǎng)基1ml進(jìn)行培養(yǎng)。熒光顯微鏡檢查轉(zhuǎn)染后的PC-3細(xì)胞，并采用含G418的培養(yǎng)基篩選以獲得陽性克隆的整合了KLF6基因的PC-3細(xì)胞，繼續(xù)傳代培養(yǎng)6周，收獲細(xì)胞懸液或取其細(xì)胞爬片待用。 【結(jié)果】重組質(zhì)粒經(jīng)過選擇性培養(yǎng)，出現(xiàn)了明顯的未相互重疊的陽性單菌落，在含Amp的LB液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)擴(kuò)增，達(dá)到了足夠的數(shù)量。使用堿裂解法抽提質(zhì)粒DNA并純化，經(jīng)電泳再次檢驗與擴(kuò)增前重組KLF6-pEGFP-C1質(zhì)粒位

8、置相同。轉(zhuǎn)染后經(jīng)熒光顯微鏡檢查可見成功轉(zhuǎn)染了KLF6-pEGFP-C1表達(dá)綠色熒光蛋白的陽性表達(dá)細(xì)胞，并采用G418篩選獲得足夠數(shù)量陽性克隆的含野生型KLF6的PC-3細(xì)胞。 【結(jié)論】通過感受態(tài)細(xì)菌的轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增、收集、裂解，分離和純化重組KLF6-pEGFP-C1質(zhì)粒DNA，獲得了足夠數(shù)量的重組KLF6-pEGFP-C1質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染KLF6-pEGFP-C1質(zhì)粒獲得陽性表達(dá)細(xì)胞，篩選獲得足夠數(shù)量陽性克隆的包含野生型KLF6的PC-

9、3細(xì)胞。 第三部分：轉(zhuǎn)染抑癌基因KLF6后對PC-3細(xì)胞生長抑制和細(xì)胞周期的影響【目的】研究和探討轉(zhuǎn)染野生型KLF6后，PC-3細(xì)胞的生長是否會受到抑制，是否會有顯著的細(xì)胞凋亡出現(xiàn)，探討野生型KLF6是否會影響PC-3的細(xì)胞周期進(jìn)展和分布比例，以判斷KLF6在前列腺癌的發(fā)生和進(jìn)展方面是否扮演著關(guān)鍵性的作用，進(jìn)而說明KLF6是否是前列腺癌病因?qū)W中的一個重要抑癌基因，同時探討野生型KLF6是否可用于激素非依賴性前列腺癌的治療。

10、 【材料和方法】將5×106/L的未轉(zhuǎn)染KLF6和轉(zhuǎn)染后的PC-3細(xì)胞接種于96孔板，貼壁生長48h后棄上清，加入200μl新配制的5g/L濃度的MTT，37℃孵育4h，棄上清加入150u1的二甲基亞砜(DMSO)，混勻后于酶標(biāo)儀在490nm波長測定吸光度(A)。細(xì)胞生長抑制率=(1-實驗孔測定值/對照孔測定值)×100％。將細(xì)胞消化分離為1×106/ml的單細(xì)胞懸液，離心沉淀，PBS液洗滌3次，70％乙醇固定30min，1％Trit

11、onX-10010ml處理10min，1×10-4kg/L的Rnase1ml處理10min，2.5×10-3kg/L碘化丙錠染色30min，流式細(xì)胞儀分析轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞DNA含量變化和凋亡情況?！窘Y(jié)果】MTT法觀察顯示，轉(zhuǎn)染野生型KLF6基因后的PC-3細(xì)胞生長抑制率為(30.0±5.4)％，對照組=(10.6±1.2)％，兩組比較P＜0.01，轉(zhuǎn)染后PC-3細(xì)胞生長增殖受到明顯的抑制。流式細(xì)胞儀定量檢測表明轉(zhuǎn)染野生型KLF6基因48h后

12、，PC-3細(xì)胞出現(xiàn)較為明顯的凋亡峰，Ap峰=(24.3±2.3)％，與對照組(5.2±0.7)％比較有顯著差異(P＜0.01)，說明轉(zhuǎn)染野生型KLF6誘導(dǎo)了PC-3細(xì)胞凋亡的出現(xiàn)，。轉(zhuǎn)染野生型KLF6基因48小時后的PC-3細(xì)胞的細(xì)胞周期中G0/G1期占(76.0±9.8)％，對照組=(58.6±7.3)％，兩組比較P＜0.01，顯示細(xì)胞周期阻滯以G0/G1期為主，同時S期和G2/M期細(xì)胞比例顯著減少。 【結(jié)論】轉(zhuǎn)染野生型KLF

13、6后PC-3細(xì)胞的生長增殖受到顯著的抑制，說明轉(zhuǎn)染野生型KLF6后抑制了PC-3細(xì)胞的過度增殖。轉(zhuǎn)染后PC-3細(xì)胞的G0/G1期比例增加，S期和G2/M期比例減少，說明抑野生型KLF6主要將PC-3的細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期。野生型KLF6通過阻滯PC-3的細(xì)胞周期進(jìn)展，部分地逆轉(zhuǎn)了PC-3細(xì)胞的惡性表型，并且誘導(dǎo)前列腺癌PC-3細(xì)胞的凋亡，可以起到治療激素非依賴性前列腺癌的作用。 第四部分：轉(zhuǎn)染抑癌基因KLF6對PC-3細(xì)胞

14、Bcl-2和CyclinD1蛋白表達(dá)影響【目的】探討轉(zhuǎn)染了野生型KLF6后的前列腺癌PC-3細(xì)胞中CyclinD1和bcl-2蛋白的表達(dá)是否會受到影響，并探討其表達(dá)的變化與KLF6的作用及其機(jī)理和途徑之間的關(guān)系。 【材料和方法】采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測bcl-2和CyclinD1蛋白的表達(dá)。對照組和轉(zhuǎn)染組PC-3細(xì)胞爬片經(jīng)Hank's液漂洗，丙酮固定10min，乙醇脫片及漂洗后，選用含鼠抗人單克隆抗體為第一抗體(1：100)，生

15、物素標(biāo)記第二抗體(1：100)的即用型SP試劑盒，依次按UltraSensitiveS-P免疫組化染色步驟染色，以出現(xiàn)明顯DAB棕黃色者判斷為陽性表達(dá)。 【結(jié)果】轉(zhuǎn)染野生型抑癌基因KLF6后的PC-3細(xì)胞中bcl-2蛋白的表達(dá)率為(18.7±3.2)％，對照組=(41.8±5.9)％，兩組比較P＜0.05。轉(zhuǎn)染野生型抑癌基因KLF6后的PC-3細(xì)胞中CyclinD1蛋白的表達(dá)率為(25.3±3.7)％，對照組=(38.5±4.6

16、)％,兩組比較P＜0.05。轉(zhuǎn)染了抑癌基因KLF6后的前列腺癌PC-3細(xì)胞較未轉(zhuǎn)染抑癌基因KLF6的前列腺癌PC-3細(xì)胞，CyclinD1和bcl-2蛋白的表達(dá)發(fā)生了顯著下調(diào)。 【結(jié)論】抑癌基因KLF6的表達(dá)可以下調(diào)前列腺癌PC-3細(xì)胞中CyclinD1和bcl-2蛋白的表達(dá)，結(jié)合流式細(xì)胞檢測的細(xì)胞凋亡率結(jié)果，提示KLF6很可能通過下調(diào)CyclinD1和bcl-2蛋白的表達(dá)而阻礙細(xì)胞周期進(jìn)展、誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞凋亡和抑制其生長增殖