RNAi對前列腺癌PC-3細(xì)胞survivin基因表達(dá)的抑制作用.pdf

1、本實驗設(shè)計、構(gòu)建針對survivin基因的siRNA表達(dá)載體(smalI interference RNA expression vector)，轉(zhuǎn)染入人雄激素非依賴性前列腺癌PC-3細(xì)胞中，觀察siRNA表達(dá)載體抑制survivin mRNA及survivin蛋白表達(dá)、誘導(dǎo)人前列腺癌PC-3細(xì)胞凋亡的效果，為進(jìn)一步篩選有效siRNA提供實驗基礎(chǔ)，探討前列腺癌基因治療的新途徑。 研究方法： 首先在Genebank中找到s

2、urvivin的cDNA序列，參考siRNA的設(shè)計原則，根據(jù)在線siRNA靶點設(shè)計軟件siRNA design support system確定2條靶序列及一條陰性序列。用BLAST檢索設(shè)計的DNA片段序列的特異性，與人類其他編碼序列無同源性，陰性序列與survivin mRNA無同源性。構(gòu)建survivin基因的siRNA表達(dá)載體一重組質(zhì)粒pBSsi-survivin，并經(jīng)序列分析證實序列完全正確，分別命名為質(zhì)粒A、質(zhì)粒B、質(zhì)粒C(陰

3、性序列)。 人PC-3細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10％胎牛血清1640培養(yǎng)基中，置于37℃，5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，每日在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁情況、細(xì)胞生長情況等。待細(xì)胞匯合度達(dá)到95％-100％，用0.25％的胰酶消化，以1∶2傳代擴(kuò)增，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。(1)細(xì)胞生長到占培養(yǎng)瓶底約90％時消化，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105/ml，按每孔1ml等量加到多組6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)。于30-50％細(xì)胞匯合度時(處于對數(shù)生長期)準(zhǔn)備進(jìn)行轉(zhuǎn)染。(2)實驗

4、分為四組，分別為質(zhì)粒A轉(zhuǎn)染組、質(zhì)粒B轉(zhuǎn)染組、陰性序列轉(zhuǎn)染組(質(zhì)粒C組)及空白對照組，分別轉(zhuǎn)染前列腺癌PC-3細(xì)胞。轉(zhuǎn)染按invitrogen公司LipofectamineTM 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法說明書操作。前3組內(nèi)質(zhì)粒與Lipofectamine<'TM>2000采用1∶6比例。(3)將脂質(zhì)體及質(zhì)粒于室溫下放置，用前混勻。在含有Opti-MEM I低血清培養(yǎng)基100uEp管中加入質(zhì)粒2ug，輕輕混勻。對照組不加質(zhì)粒，加入同體積的Opt

5、i-MEM I低血清培養(yǎng)基。(4)使用前輕輕混合Lipofectamine<'TM>2000。在另一個Ep管中用Opti-MEM I低血清培養(yǎng)基100ul稀釋Lipofectamine<'TM>2000 12ul，輕輕混勻后在室溫下孵育5分鐘。(5)混合稀釋的質(zhì)粒和稀釋的Lipofectamine<'TM>2000。輕輕混合，在室溫下孵育20分鐘，以允許復(fù)合物的形成。在30分鐘內(nèi)混合稀釋的Lipofectamine<'TM>2000和稀

6、釋的質(zhì)粒。更長的孵育時間可能會降低活性。(6)培養(yǎng)細(xì)胞去上清，用Opti-MEM I低血清培養(yǎng)基洗一次，加800ul Opti-MEM I低血清培養(yǎng)基，將質(zhì)粒一Lipofectamine<'TM>2000復(fù)合物加入到每一個包含細(xì)胞和培養(yǎng)基的孔中。通過輕輕地前后搖動培養(yǎng)板混合。(7)轉(zhuǎn)染4h后換用含10％胎牛血清1640培養(yǎng)基，終止轉(zhuǎn)染。于37℃，5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24小時后加1.2ug/ml嘌呤霉素篩選，至空白對照組細(xì)胞全部死

7、亡后，嘌呤霉素濃度減半繼續(xù)培養(yǎng)，獲得陽性克隆細(xì)胞擴(kuò)增并保存。 半定量RT-PCR檢測細(xì)胞內(nèi)survivin mRNA表達(dá)的變化，圖像用Bandscan5.0軟件作灰度掃描，用survivin與內(nèi)參β-actin灰度值比值表示各樣本survivin蛋白表達(dá)強(qiáng)度。Western blot檢測細(xì)胞內(nèi)survivin蛋白表達(dá)的變化，圖像用Bandscan5.0軟件作灰度掃描，用survivin與內(nèi)參β-actin灰度值比值表示各樣本su

8、rvivin mRNA表達(dá)強(qiáng)度。流式細(xì)胞儀檢測質(zhì)粒誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，觀察siRNA表達(dá)載體細(xì)胞凋亡的影響。實驗所得計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS11.0進(jìn)行分析，方差分析法進(jìn)行各組間差異的比較，P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。 研究結(jié)果： 構(gòu)建的重組質(zhì)粒pBSsi-survivin經(jīng)DNA測序技術(shù)證實重組質(zhì)粒序列與所設(shè)計序列完全一致，表明針對survivin基因的siRNA表達(dá)載體構(gòu)建成功。采用Westernblot

9、檢測轉(zhuǎn)染后各組PC-3細(xì)胞中Survivin蛋白的表達(dá)，結(jié)果4組細(xì)胞Survivin蛋白的表達(dá)強(qiáng)度分別為18.94％±0.63％、16.35±0.23％、46.41％±0.76％、46.20±1.47％。質(zhì)粒A、B組與后兩組相比差異均有顯著性意義(p=0.000)，質(zhì)粒A、B組間比較差異有顯著性意義(p=0.007)，陰性序列組、空白對照組間比較差異無顯著性意義(p=0.771)。采用RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后各組PC-3細(xì)胞中surviv

10、in mRNA的表達(dá)，結(jié)果各組細(xì)胞中survivin mRNA的表達(dá)強(qiáng)度分別為27.94％±1.43％、24.51％±1.37％、49.46％±0.71％、48.49％±1.32％。質(zhì)粒A、B組與后兩組相比差異均有顯著性意義(p=0.000)，質(zhì)粒A、B組間比較差異有顯著性意義(p=0.01)，陰性序列組、空白對照組間比較差異無顯著性意義(p=0.365)。經(jīng)Annexin V與PI雙染色流式細(xì)胞儀檢測PC-3細(xì)胞的凋亡，質(zhì)粒A轉(zhuǎn)染組的

11、PC-3細(xì)胞凋亡率為12.80％±1.33％，質(zhì)粒B轉(zhuǎn)染組的PC-3細(xì)胞凋亡率為16.48％±1.00％，陰性對照組為3.03％±0.62％，空白對照組為2.96％±0.41％。質(zhì)粒A、B組與后兩組相比差異均有顯著性意義(p=0.000)，質(zhì)粒A、B組間比較差異有顯著性意義(p=0.001)，陰性序列組、空白對照組間比較差異無顯著性意義(p=0.934)。 研究結(jié)論： 實驗采用RNAi技術(shù)，以survivin為靶基因，成

12、功設(shè)計、構(gòu)建兩條能夠在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)針對survivin基因的siRNA表達(dá)載體，為腫瘤基因治療的研究提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。實驗表明RNA干擾可有效抑制前列腺癌PC-3細(xì)胞survivin mRNA和蛋白表達(dá)，RNA干擾抑制PC-3細(xì)胞survivin基因表達(dá)誘導(dǎo)PC-3細(xì)胞凋亡增加，顯示降低survivin基因的表達(dá)可以促進(jìn)PC-3細(xì)胞發(fā)生凋亡我們設(shè)計的2組survivin的siRNA序列，均可有效抑制PC-3細(xì)胞survivin mRNA和s