鞘脂激活蛋白C促進前列腺癌細胞增殖、上調AR功能的分子機制研究.pdf

1、鞘脂激活蛋白原(Prosaposin)是一種高度保守的熱穩(wěn)定糖蛋白(65-72kDa，527氨基酸殘基)，其基因位于10號染色體長臂(q21-22)，全長17kb，有14個外顯子。鞘脂激活蛋白原經(jīng)水解后產(chǎn)生4種熱穩(wěn)定糖蛋白--鞘脂激活蛋白A、B、C、D(SaposinA、B、C、D)，它們在溶酶體酶解鞘脂的過程中發(fā)揮重要作用。另外，作為一種分泌蛋白，鞘脂激活蛋白原還具有神經(jīng)營養(yǎng)作用，能夠促進神經(jīng)膠質源性細胞突觸增長、細胞增殖以及增加其抗

2、凋亡的能力，其神經(jīng)營養(yǎng)活性位于Saposin C的N端氨基酸序列(LIDNNRTEELLY)。Prosaposin、Saposin C以及包含這一功能區(qū)域的合成肽，如Prosaptide TX14A都可以與神經(jīng)細胞膜上百日咳毒素敏感的細胞膜G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)結合，刺激神經(jīng)細胞中乙酰膽堿酯酶的活性，促進神經(jīng)細胞的生長和分化。 鞘脂激活蛋白原分布于神經(jīng)細胞和體液，除了其神經(jīng)營養(yǎng)活性之外，在外周組織的廣泛分布，提示可能還有其它

3、生物活性。2004年Koochekpour S等報道鞘脂激活蛋白原在前列腺癌組織中高表達；并通過化學合成的Saposin C以及Prosaptide TX14A進行研究，發(fā)現(xiàn)其可以通過MAPK途徑、PI3K/Akt途徑等信號通路促進前列腺癌細胞的生長、增殖、轉移和侵襲，并且抑制癌細胞的凋亡。 前列腺癌是死亡率很高的惡性腫瘤，潛伏期長，易復發(fā)，且復發(fā)后往往轉變?yōu)樾奂に胤且蕾囆郧傲邢侔?Androgen-independent pr

4、ostate cancer，AIPC)，臨床上缺乏有效的治療手段。目前發(fā)現(xiàn)有多種機制參與AIPC的演變過程，其中雄激素受體(androgen receptor,AR)相關途徑的異?；罨茿IPC發(fā)生發(fā)展的主要分子機制。AR作為核轉錄因子，通過介導雄激素的作用，結合于靶基因的特異元件AREs(androgen receptor elements)后，調節(jié)靶基因如前列腺特異抗原(Prostate-specific antigen，PSA)、

5、人腺激肽釋放酶2(human glandular kallikrein，hk2)等的表達，從而對前列腺的正常發(fā)育、調控其分泌功能發(fā)揮重要作用。而AR基因的擴增、突變，AR的輔助激活因子過表達，一些細胞因子、生長因子對AR的激素非依賴性激活，以及雄激素通過非基因組的(nongenomic)信號途徑對AR功能的調節(jié)等，使AR在激素非依賴性前列腺癌中持續(xù)活化而發(fā)揮功能。由于Saposin C以及Prosaptide TX14A能夠促進前列腺癌

6、細胞增殖，而AR在前列腺癌細胞的增殖中起重要作用，本研究旨在探討Saposin C及其功能結構域一一鞘脂激活肽NP(Neurotrophic Peptide，NP)對AR表達和功能影響。我們首先構建含有Saposin C或NP與Tat-PTD蛋白轉導結構域序列的融合蛋白的真核表達載體及其對照載體。Tat-PTD蛋白轉導域具有不依賴ATP和膜通道、高效穿過生物膜的功能，它能將與其共價連接的多肽、蛋白質及DNA等分子跨膜運輸出入幾乎所有的組

7、織和細胞。由于Saposin C為分泌蛋白，并通過膜受體介導其功能，我們在Saposin C/NP前面引入Tat-PTD，使Saposin C能通過Tat-PTD的蛋白轉導功能實現(xiàn)跨膜轉運并發(fā)揮作用。利用脂質體法轉染雄激素依賴性前列腺癌細胞(LNCaP)和雄激素非依賴性前列腺癌細胞(PC3、DU145)，通過MTT、RT-PCR、Western Blot、熒光素酶活性分析、免疫熒光技術及免疫共沉淀等方法分析Saposin C/NP對前列

8、腺癌細胞生長的影響以及對AR.基因表達和功能的影響。我們的研究結果如下： (1)載體構建：以pcDNA3.1(+)為母載體，構建真核表達載體pcDNA-TAT-NP和pcDNA-NP；以帶有myc和His標簽的pcDNA3.1/myc-HisB(-)為母載體，插入SaposinC或NP序列分別得到pcDNA-TAT-Saposin C、pcDNA-Saposin C、pcDNA-NP/His的表達載體，測序分析序列正確。RT-P

9、CR以及利用His標簽進行Western Blot實驗，分別在mRNA和蛋白水平檢測所構建載體的表達，結果表明TAT-SaposinC、SaposinC、TAT-NP、NP均能夠在前列腺癌細胞中表達； (2)確定SaposinC和NP蛋白在細胞中的定位：免疫熒光技術檢測結果表明，TAT-Saposin C定位于細胞內(nèi)及細胞膜外，而Saposin C和NP只分布于細胞內(nèi)； (3)確定Saposin C/NP對細胞增殖的影響

10、：流式細胞術結果表明，NP及TAT-NP能夠促使細胞進入S和G2/M期；MTT結果表明， TAT-Saposin C、Saposin C、TAT-NP和NP均能刺激激素依賴型及激素非依賴型前列腺癌細胞的增殖； (4)確定Saposin C/NP對AR表達和功能的影響：RT-PCR、Western Blot結果顯示，在mRNA和蛋白水平，TAT-Saposin C、Saposin C、TAT-NP和NP均能增加AR基因的表達，并增

11、強AR promoter的表達活性；通過檢測PSApromoter、hk2-3ARE報告基因的表達活性，證實TAT-Saposin C、Saposin C、TAT-NP和NP均能夠增強AR的轉錄激活活性，促進AR的靶基因PSA、hk2的表達： (5)確定SaposinC/NP對AR核定位的影響：免疫熒光結果顯示，TAT-SaposinC、Saposin C和NP在雄激素缺乏的情況下，能夠使AR激活并定位于細胞核； (6)

12、確定SaposinC/NP激活AR可能的機制：AR蛋白的磷酸化是AR活化、定位于細胞核的重要方式，MAPK和PI3K/Akt信號途徑均是使AR磷酸化的重要途徑。由于無TAT蛋白轉導結構域的SaposinC和NP定位于細胞內(nèi)，但仍然能夠促進細胞增殖，促進AR的表達、功能以及促進AR的核定位。首先通過采用百日咳毒素封閉細胞膜上的G蛋白受體，發(fā)現(xiàn)Saposin C、NP仍能增強AR的轉錄激活功能，促進PSA promoter和hk2-3ARE

13、的表達活性，說明膜受體可能不參與Saposin C、NP激活AR的過程；采用蛋白酶抑制劑封閉PI3K/Akt途徑后，并不影響胞內(nèi)Saposin C對ERK的磷酸化，繼而不影響AR的磷酸化活化；采用免疫熒光和免疫共沉淀技術進一步證實Saposin C、NP分別與Src蛋白產(chǎn)生蛋白一蛋白間相互作用，同時促進Src與AR蛋白一蛋白間的相互作用。上述結果提示Saposin C/NP活化AR的過程可能不依賴于細胞膜G蛋白受體，可能通過與Src蛋白

14、相互作用，促進Src與AR的結合進而激活Src活化AR的信號途徑，最終使AR磷酸化激活。 總之，真核表達載體Saposin C/NP在細胞內(nèi)的表達能夠促進前列腺癌細胞增殖，增強AR的表達和功能,促進AR核定位，其機制可能不依賴于細胞膜上的G蛋白受體途徑，而是通過與非受體酪氨酸蛋白激酶Src產(chǎn)生蛋白一蛋白相互作用，活化Src激活AR的信號途徑，使AR磷酸化激活，促進下游靶基因的表達，進而促進細胞增殖。另外，我們的實驗結果也表明，S