PSCA基因在前列腺癌細(xì)胞的表達(dá)及其功能研究.pdf

1、背景和目的：據(jù)報(bào)道，2016年美國新發(fā)癌癥將達(dá)到1,685,210，癌癥死亡人數(shù)將達(dá)到595,690。其中前列腺癌（PCa）新發(fā)病例將達(dá)到180,890人，死亡病例達(dá)26,120人，前列腺癌已經(jīng)成為了美國男性中發(fā)病率最高，死亡率第二的惡性腫瘤。
　　盡管目前治療局限性前列腺癌已經(jīng)取得了巨大的進(jìn)步，包括可以采用外科手術(shù)或放射治療，但是隨著病情的進(jìn)展，疾病最終會(huì)進(jìn)展成轉(zhuǎn)移性的，去勢抵抗型前列腺癌（CRPC）。目前對(duì)于CRPC沒有有效的

2、治療辦法，預(yù)后較差。免疫治療是目前比較理想的治療手段，主要通過激活病人自身的免疫系統(tǒng)來誘導(dǎo)殺傷腫瘤細(xì)胞。但是，免疫治療急需探尋一個(gè)理想的治療靶點(diǎn)。
　　Reiter等使用代表性差異分析法（RDA）在LAPC-4移植瘤中評(píng)估了多種抗原，確認(rèn)前列腺癌干細(xì)胞抗原（PSCA）具有前列腺特異性，并且在大部分前列腺癌中過表達(dá)。PSCA定位在染色體8q24.2，由660bp組成，有一個(gè)氨基端和羧基端的糖基磷脂酰肌醇（GPI）序列，以及大量的糖基

3、化位點(diǎn)。許多研究已經(jīng)證實(shí)PSCA與前列腺癌的進(jìn)展及轉(zhuǎn)移相關(guān)，尤其在骨轉(zhuǎn)移中全部呈陽性表達(dá)。課題組也發(fā)現(xiàn)PSCA的表達(dá)與前列腺癌分期，Gleason評(píng)分，雄激素抵抗呈正相關(guān)。因此，PSCA可能是前列腺癌免疫治療的一個(gè)良好的靶點(diǎn)。
　　現(xiàn)有的關(guān)于PSCA的研究大都集中在研究臨床前列腺癌標(biāo)本與臨床分期，病理分級(jí)，及預(yù)后等的關(guān)系方面，而關(guān)于PSCA在前列腺癌中的具體的生物學(xué)功能，以及PSCA在前列腺癌中的具體作用機(jī)制，仍然不清楚。PSCA

4、屬于胸腺細(xì)胞分化抗原1/淋巴細(xì)胞抗原6家族（Thy-1/Ly-6)，Thy-1/Ly-6家族的成員功能非常多樣，包括T細(xì)胞的激活，以及神經(jīng)系統(tǒng)中的凋亡調(diào)節(jié)等。
　　因此，為了研究PSCA在前列腺癌中的生物學(xué)功能，并且探討其影響前列腺癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，我們課題組首先測定了PSCA在各種前列腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)，然后構(gòu)建了沉默及過表達(dá)PSCA的穩(wěn)定細(xì)胞株，通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)探討了PSCA在前列腺癌增殖，遷移及侵襲中的作用及其機(jī)制。
　

5、　方法：
　　1．qRT-PCR及Western blot檢測前列腺癌細(xì)胞株中PSCA的表達(dá)水平。使用qRT-PCR檢測雄激素去勢抵抗型前列腺癌細(xì)胞株DU145，雄激素依賴型細(xì)胞株LNCAP，及正常的前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1細(xì)胞株中PSCA mRNA及蛋白的表達(dá)，初步明確各細(xì)胞株P(guān)SCA的表達(dá)水平。
　　2．構(gòu)建穩(wěn)定沉默PSCA及穩(wěn)定過表達(dá)PSCA的細(xì)胞株。首先篩選干擾效率最高的干擾序列，包裝成慢病毒液，然后病毒液感染DU

6、145細(xì)胞株，嘌呤霉素篩選構(gòu)建穩(wěn)定沉默 PSCA的 DU145細(xì)胞株 DU145 shRNA＃1，及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染無關(guān)序列的DU145穩(wěn)定細(xì)胞株DU145 scramble。同樣，首先合成表達(dá)PSCA全長的序列，包裝成慢病毒液，病毒液感染LNCAP細(xì)胞株，嘌呤霉素篩選構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)PSCA的LNCAP細(xì)胞株LNCAP PSCA，及對(duì)照的空載體LNCAP穩(wěn)定細(xì)胞株LNCAP vector。
　　3． PSCA對(duì)前列腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

7、。采用已經(jīng)構(gòu)建好的穩(wěn)定沉默 PSCA的 DU145細(xì)胞株，及穩(wěn)定過表達(dá)PSCA的LNCAP細(xì)胞株，首先進(jìn)行了體外的MTS和平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測前列腺癌細(xì)胞的增殖，采用劃痕實(shí)驗(yàn)，transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)探討了PSCA對(duì)前列腺癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響。進(jìn)一步在體內(nèi)研究了PSCA對(duì)前列腺癌移植瘤生長，轉(zhuǎn)移的影響，我們給SCID鼠接種了穩(wěn)定沉默PSCA的DU145細(xì)胞株及穩(wěn)定過表達(dá)PSCA的LNCAP細(xì)胞株，觀察移植瘤的體積，重量變化，并

8、且行小鼠的 MRI檢測是否發(fā)生了侵襲和轉(zhuǎn)移。取下移植瘤組織，行相關(guān)指標(biāo)的 qRT-PCR，WB，及免疫組化的檢測。
　　4． PSCA調(diào)控前列腺癌增殖及遷移侵襲的機(jī)制。為了進(jìn)一步探討PSCA影響前列腺癌增殖，遷移及侵襲的作用機(jī)制，我們研究了穩(wěn)定沉默PSCA的DU145的細(xì)胞株和體內(nèi)移植瘤，及穩(wěn)定過表達(dá)PSCA的LNCAP細(xì)胞株和體內(nèi)移植瘤中PI3K/AKT及MAPK/ERK通路的情況，我們采用了Western blot的方法檢測p

9、-AKT，AKT，p-ERK1/2及ERK1/2在各個(gè)細(xì)胞株及移植瘤中的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1．PSCA表達(dá)在DU145中較高，在LNCAP中較低。對(duì)前列腺癌細(xì)胞株進(jìn)行了PSCA mRNA及蛋白水平的分析，結(jié)果顯示雄激素去勢抵抗型前列腺癌細(xì)胞株DU145的PSCA水平相對(duì)較高，而雄激素依賴型細(xì)胞株LNCAP水平相對(duì)較低，說明了在前列腺癌細(xì)胞中，PSCA的表達(dá)隨雄激素敏感到雄激素抵抗逐漸升高，與我們課題組前期在臨床標(biāo)本

10、中的研究趨勢一致。
　　2．成功構(gòu)建了下調(diào)PSCA的DU145穩(wěn)定細(xì)胞株和上調(diào)PSCA的LNCAP穩(wěn)定細(xì)胞株。選取了PSCA水平相對(duì)較高的DU145進(jìn)行下調(diào)表達(dá)，PSCA水平相對(duì)較低的LNCAP進(jìn)行上調(diào)表達(dá)，進(jìn)行穩(wěn)定細(xì)胞株的構(gòu)建。穩(wěn)定株P(guān)SCA mRNA及蛋白的檢測結(jié)果證實(shí)成功構(gòu)建了下調(diào)PSCA的DU145穩(wěn)定細(xì)胞株和上調(diào)PSCA的LNCAP穩(wěn)定細(xì)胞株。
　　3．PSCA可抑制前列腺癌的增殖，促進(jìn)前列腺癌的體外遷移侵襲。體內(nèi)

11、外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明沉默PSCA后，前列腺癌細(xì)胞增殖及體內(nèi)移植瘤的生長均明顯增加，而過表達(dá)恰好相反。同時(shí)體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)沉默PSCA后，遷移和侵襲降低，過表達(dá)則反之。同時(shí)在體內(nèi)移植瘤實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)各個(gè)細(xì)胞株均沒有發(fā)生明顯的侵襲和轉(zhuǎn)移，說明了PSCA可抑制前列腺癌癌細(xì)胞的增殖和移植瘤的生長，促進(jìn)前列腺癌體外的遷移和侵襲，PSCA對(duì)前列腺癌體內(nèi)的侵襲和轉(zhuǎn)移需要進(jìn)一步來研究確認(rèn)。
　　4. PSCA通過PI3K/AKT通路減緩前列腺癌的增殖，促進(jìn)

12、前列腺癌的體外遷移和侵襲。進(jìn)一步探討了影響前列腺癌細(xì)胞增殖及侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制，我們通過Western blot檢測了PI3K/AKT, MAPK/ERK通路，研究發(fā)現(xiàn)，無論是體外，還是體內(nèi)，下調(diào)PSCA的表達(dá)促進(jìn)了p-AKT水平的增加，而過表達(dá)反之；同時(shí)，無論是PSCA敲低的DU145，還是PSCA過表達(dá)的LANCP，p-ERK1/2的水平都沒有發(fā)現(xiàn)明顯的差異。結(jié)果表明，PSCA可能是通過PI3K/AKT途徑抑制增殖，同時(shí)促進(jìn)體外的遷移和