人PDLIM4基因在前列腺癌的表達(dá)調(diào)控研究.pdf

1、前列腺癌(prostate cancer,PCa)是歐美國(guó)家常見(jiàn)的腫瘤,居男性腫瘤死亡原因第二位,僅次于肺癌。我國(guó)前列腺癌的發(fā)病率雖低于西方國(guó)家,但隨著生活水平的提高及人口老齡化發(fā)展,其發(fā)病率正迅速上升,成為危害中老年男性健康的主要疾病。前列腺癌的發(fā)病及惡化轉(zhuǎn)移機(jī)制復(fù)雜,不僅與種族,飲食、生活習(xí)慣等關(guān)系密切,并且癌基因和抑癌基因及其相應(yīng)的信號(hào)通路的異常調(diào)控直接參與了前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展[1,2]。
　　 Vanaja等[3]根據(jù)

2、芯片結(jié)果分析PDLIM4(PDZ and LIM domain4)基因在前列腺癌中表達(dá)發(fā)生沉默。PDLIM4基因,又稱(chēng)RJL(reversion-induced LIM gene),是定位于5號(hào)染色體長(zhǎng)臂上31.1的抑癌基因,編碼含PDZ和LIM區(qū)域的蛋白,生物學(xué)功能目前尚未清楚[4,5]。研究發(fā)現(xiàn)PDLIM4基因在正常細(xì)胞中普遍表達(dá),而在腫瘤細(xì)胞中常發(fā)生缺失,通過(guò)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染恢復(fù)表達(dá)可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖和集落形成,并促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡[6]

3、。初步認(rèn)為具有抑癌基因的功能。目前研究表明,PDLIM4低表達(dá)與雜合子缺失、啟動(dòng)子區(qū)域CpG島的異常高甲基化密切相關(guān),且PDLIM4甲基化失活常和前列腺癌預(yù)后較差相關(guān)[6,7]。
　　 DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)主要研究?jī)?nèi)容之一。DNA甲基化主要指基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG島中胞嘧啶C發(fā)生甲基化,由于DNA甲基化是一個(gè)可逆的過(guò)程,通過(guò)藥物逆轉(zhuǎn)啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化可使沉默的基因恢復(fù)表達(dá)[8-11]。DNA甲基化可導(dǎo)致抑癌基因轉(zhuǎn)錄失活,進(jìn)而影

4、響腫瘤的發(fā)生發(fā)展[12-15]。人前列腺癌中PDLIM4基因啟動(dòng)子核心區(qū)域中含有多個(gè)CpG島,已證實(shí)其CpG島高度甲基化與PDLIM4表達(dá)下調(diào)密切相關(guān)但其調(diào)控機(jī)制尚不明確。
　　 我們首先通過(guò)免疫組化檢測(cè)中國(guó)漢族人群中前列腺癌患者PDLIM4在前列腺增生組織及前列腺癌組織中的表達(dá),已確定該基因的表達(dá)是否存在種族差異。同時(shí)檢測(cè)相關(guān)的甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase,DNMTs)DNMT3A及DNMT3B在相應(yīng)

5、組織中的表達(dá)水平。結(jié)果顯示在前列腺癌組織中PDLIM4的表達(dá)明顯低于正常癌旁組織及前列腺增生組織,與國(guó)外的研究報(bào)道一致,表明該基因的表達(dá)無(wú)顯著的種族差異。而DNMT3A及DNMT3B表達(dá)在增生組織及癌組織中無(wú)明顯差異。
　　 為了研究PDLIM4基因在前列腺癌中低表達(dá)的調(diào)控機(jī)制,我們通過(guò)Westernblotting確定前列腺癌激素依賴(lài)及非依賴(lài)細(xì)胞株中PDLIM4蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示,PDLIM4在正常人前列腺永生細(xì)胞株RW

6、PE1中表達(dá),而在激素非依賴(lài)的前列腺癌細(xì)胞PC-3、激素依賴(lài)的LNCaP中表達(dá)沉默。經(jīng)過(guò)甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-aza-dc處理后,LNCaP細(xì)胞中PDLIM4的表達(dá)明顯上調(diào),而RWPE1和PC3表達(dá)未發(fā)生明顯改變,表明PDLIM4的表達(dá)不僅與其啟動(dòng)子CpG島甲基化有關(guān),可能還存在其它的調(diào)控機(jī)制。
　　 由于PDLIM4的表達(dá)調(diào)控發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平,我們以基因組DNA為模板,通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得PDLIM4基因啟動(dòng)子序列片段,插入到pGL

7、3-Basic報(bào)告基因載體,分別得到含有3kb和1.2kb的PDLIM4基因啟動(dòng)子的兩個(gè)報(bào)告基因質(zhì)粒pGL3-PDLIM4-3kb和pGL3-PDLIM4-1.2kb。另外,pGL3-PDLIM4-1.2kb質(zhì)粒運(yùn)用外切酶Ⅲ將啟動(dòng)子從5’端截短獲得系列不同短片段的啟動(dòng)子序列,并構(gòu)建其熒光素酶報(bào)告基因的重組質(zhì)粒,得到5個(gè)含不同長(zhǎng)度啟動(dòng)子序列的報(bào)告基因載體:pGL3-PDLIM4—970bp,pGL3一PDLIM4-803bp,pGL3-P

8、DLIM4-653bp,pGL3-PDLIM4-645bp,pGL3-PDLIM4—627bp。利用PDLIM4啟動(dòng)子及其不同截短體報(bào)告基因轉(zhuǎn)染不同組織來(lái)源細(xì)胞系及各前列腺細(xì)胞株,檢測(cè)其表達(dá)情況。結(jié)果表明,PDLIM4基因長(zhǎng)片段的3kb和1.2kb啟動(dòng)子熒光素酶質(zhì)粒,在乳腺癌細(xì)胞株、宮頸癌細(xì)胞株、人口腔上皮腫瘤細(xì)胞株、前列腺癌細(xì)胞株中均有不同程度的表達(dá)活性,,其中在前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3、LNCaP中表達(dá)較低。而不同長(zhǎng)度的PDLIM4啟動(dòng)

9、子報(bào)告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PC-3、LNCaP的結(jié)果顯示,pGL3-PDLIM4-1.2kb表達(dá)活性最強(qiáng),pGL3-PDLIM4-970bp表達(dá)活性最弱,說(shuō)明在啟動(dòng)子-1275bp至-970bp區(qū)域內(nèi)可能存在一個(gè)正調(diào)控元件。
　　 前列腺癌細(xì)胞株轉(zhuǎn)染PDLIM4啟動(dòng)子,經(jīng)5-aza—dc處理后,與未處理的細(xì)胞比較啟動(dòng)子活性變化。結(jié)果顯示,LNCaP經(jīng)5-aza-dc處理后PDLIM4的啟動(dòng)子活性明顯上調(diào)(p<0.05),而PC-3經(jīng)5-

10、aza—dc處理后啟動(dòng)子活性發(fā)生下調(diào),RWPE1未發(fā)生明顯改變。經(jīng)5-aza—dc處理后啟動(dòng)子活性的變化與蛋白表達(dá)水平的變化相一致。說(shuō)明了甲基化在激素依賴(lài)的LNCaP是主要的調(diào)控機(jī)制,而在激素非依賴(lài)的PC-3細(xì)胞中可能存在非甲基化調(diào)控機(jī)制。
　　 綜上所述,抑癌基因PDLIM4在中國(guó)漢族人群前列腺癌組織和激素依賴(lài)的前列腺癌細(xì)胞中沉默,其啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化對(duì)基因的沉默起著重要作用,去甲基化后可使PDLIM4在轉(zhuǎn)錄和蛋白翻譯水平上恢