MicroRNAlet-7a在前列腺癌細(xì)胞中的表達(dá)和作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　miRNAs是一種內(nèi)源性的，長(zhǎng)約22nt的非編碼小RNA，通過(guò)與靶基因3’UTR互補(bǔ)序列特異性的結(jié)合而發(fā)揮重要的調(diào)控作用。許多文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iRNAs對(duì)腫瘤的診斷和治療都有重要意義。以往的研究表明miRNAlet-7在肺癌中能明顯抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，它可以通過(guò)下調(diào)原癌基因RAS/c-MYC和HMGA-2的蛋白表達(dá)而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。但是，let-7a在前列腺癌中的表達(dá)情況和作用機(jī)制卻鮮有研究報(bào)道。因此，我們運(yùn)用體內(nèi)和體外

2、方法研究let-7a在前列腺癌中的表達(dá)情況和它對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響，并驗(yàn)證細(xì)胞周期相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子E2F2和CCND2是否是let-7a的靶基因。
　　材料與方法：
　　1.細(xì)胞培養(yǎng)與組織收集：人前列腺癌細(xì)胞系LNCaP、DU145、PC3及PrEC(前列腺上皮細(xì)胞)置于10％胎牛血清中培養(yǎng)；26例前列腺癌及周?chē)＝M織標(biāo)本來(lái)源于西京醫(yī)院泌尿外科。
　　2.質(zhì)粒的構(gòu)建和轉(zhuǎn)染：let-7a用miRNA分離試劑盒擴(kuò)增及純化。擴(kuò)

3、增后的產(chǎn)物克隆進(jìn)真核表達(dá)質(zhì)粒EcoRI/PstI位點(diǎn)，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-let-7a-GFP。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染前列腺癌細(xì)胞系PC3并篩選后得到穩(wěn)定表達(dá)let-7a的前列腺癌細(xì)胞系PC3-let-7a-GFP及空白對(duì)照PC3-GFP。同時(shí)用人工合成的let-7amimics和空白對(duì)照（NC）或者let-7a抑制劑let-7a-inhibitor以及空白對(duì)照NCinhibitor轉(zhuǎn)染PC3和LNCaP。
　　3.總RNA提取和實(shí)時(shí)

4、定量反轉(zhuǎn)錄PCR:按試劑盒操作提取細(xì)胞和組織總RNA，用相應(yīng)的引物擴(kuò)增let-7a，CCND2和E2F2。
　　4.細(xì)胞活性檢測(cè)分析：將NC、let-7a、NCinhibitor和let-7ainhibitor轉(zhuǎn)染前列腺癌細(xì)胞性PC3和LNCaP，觀察5天內(nèi)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。與3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽孵育后將細(xì)胞溶解于二甲基亞砜中，并以490nm波長(zhǎng)測(cè)量吸光度。
　　5.軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn)：將離散的

5、PC3-let-7a-GFP和PC3-GFP細(xì)胞至于上層鋪有0.7％軟瓊脂的12孔板中，18天后計(jì)數(shù)集落大于100um的分離到下層含1.2％的軟瓊脂中的細(xì)胞數(shù)量。
　　6.細(xì)胞周期分析：收集72小時(shí)后轉(zhuǎn)染NC、let-7a(mimics)、NCinhibitor和let-7ainhibitor的PC3細(xì)胞和LNCaP細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液洗滌并至于4°C酒精過(guò)夜后，重懸于500ul碘化丙啶中。流式細(xì)胞儀檢測(cè)G0-G1期、S期和G2-

6、M中的細(xì)胞含量。
　　7.雙熒光素酶報(bào)告基因分析：用相應(yīng)的引物擴(kuò)增E2F2和CCND2的3’UTR，并對(duì)其與let-7a的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)突變獲得變異型的E2F2和CCND2的3’UTR。將E2F2和CCND2的3’UTR分別克隆進(jìn)表達(dá)質(zhì)粒pGL3中。與pRL-TK，NC、let-7a(mimics)或者pRL-TK，NCinhibitor和let-7ainhibitor共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞；同時(shí)將變異型的E2F2和CCND2的3

7、’UTR分別克隆進(jìn)表達(dá)質(zhì)粒pGL3中，與pRL-TK，NC、let-7a(mimics)共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。檢測(cè)熒光素酶活性降低情況。
　　8.免疫印跡分析：前列腺癌和周?chē)＝M織蛋白以及轉(zhuǎn)染let-7a和對(duì)照的細(xì)前列腺癌細(xì)胞系行蛋白電泳分離后至置于醋酸纖維膜上分離蛋白。用相應(yīng)的一抗抗體孵育過(guò)夜。繼而用相應(yīng)FITC標(biāo)記的二抗孵育并洗滌后用遠(yuǎn)紅外成像系統(tǒng)檢測(cè)E2F2、CCND2、CDK4、K-ras的蛋白含量，β-actin作為

8、內(nèi)參。
　　9.裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)：各五只裸鼠皮下注射～1×106的PC3-let-7a-GFP細(xì)胞或者PC3-GFP細(xì)胞，4周后處死裸鼠并觀察成瘤情況。對(duì)腫瘤標(biāo)本進(jìn)行免疫印跡分析E2F2和CCND2的蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.let-7a在前列腺癌組織和癌細(xì)胞中表達(dá)下降。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示對(duì)比正常組織，let-7a在前列腺癌組織中的含量下降約43％；對(duì)比于正常前列腺上皮細(xì)胞PrEC，let-7a的含量在LNC

9、ap中下降30％，在PC3和DU-145中下降約50％(*p<0.05;**p<0.01)。
　　2.let-7a抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，并誘發(fā)細(xì)胞周期G0-G1阻滯。轉(zhuǎn)染let-7a質(zhì)粒后，PC3-let-7a-GFP中l(wèi)et-7a含量增加3倍以上，轉(zhuǎn)染let-7amimics后PC3細(xì)胞中l(wèi)et-7a含量增加10倍以上(p<0.01)，表明轉(zhuǎn)染成功?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞克隆形成能力下降40％(p<0.01)；而MTT生

10、長(zhǎng)曲線(xiàn)提示無(wú)論是PC3細(xì)胞還是LNCaP細(xì)胞，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染let-7a后細(xì)胞生長(zhǎng)出現(xiàn)明顯抑制(p<0.05)；流式細(xì)胞周期分析表明轉(zhuǎn)染let-7a后，PC3和LNCaP細(xì)胞中G0-G1期細(xì)胞含量分別增加約30％和16％；相應(yīng)S期細(xì)胞含量分別減少～50％和20％；而與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染let-7ainhibitor的PC3和LNCaP細(xì)胞中G0-G1期細(xì)胞含量分別減少約23％和19％；相應(yīng)S期細(xì)胞含量分別增加約33％和25％(*p<0

11、.05;**p<0.01)。
　　3.let-7a直接靶向調(diào)控E2F2和CCND2。轉(zhuǎn)染let-7a(mimics)和變異型CCND2或E2F2后的HEK293細(xì)胞中熒光素酶活性未見(jiàn)改變；而轉(zhuǎn)染野生型CCND2和E2F2的HEK293細(xì)胞中熒光素酶活性分別降低約30％和50％(**p<0.01)。相對(duì)于對(duì)照組，轉(zhuǎn)染let-7ainhibitor的HEK293細(xì)胞中熒光素酶活性未見(jiàn)明顯改變，表明E2F2和CCND2直接受let-7a

12、靶向調(diào)控，而HEK293細(xì)胞中的let-7a含量對(duì)實(shí)驗(yàn)無(wú)明顯影響。
　　4.let-7a抑制E2F2、CCND2mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)。實(shí)時(shí)定量PCR提示對(duì)比PrEC和正常前列腺組織，E2F2和CCND2的mRNA在前列腺癌細(xì)胞系LNCaP、PC3、DU-145和癌組織中表達(dá)增加(*p<0.05;**p<0.01)；而轉(zhuǎn)染let-7a后，PC3和LNCaP細(xì)胞中E2F2和CCND2的mRNA含量明顯下調(diào)(*p<0.05;**p<0.

13、01)。免疫印跡分析表明轉(zhuǎn)染前后CDK4的蛋白表達(dá)量未見(jiàn)明顯差異；E2F2和CCND2蛋白含量在前列腺癌組織中表達(dá)明顯高于對(duì)照，而轉(zhuǎn)染let-7a后，前列腺癌細(xì)胞系中E2F2和CCND2以及k-ras的蛋白含量明顯降低。
　　5.let-7a體內(nèi)抑制前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)裸鼠荷瘤4周后，腫瘤質(zhì)量和腫瘤/小鼠體積都有明顯差異，轉(zhuǎn)染let-7a的裸鼠腫瘤明顯小于對(duì)照組(p<0.01)。腫瘤中E2F2和CCND2蛋白含量都明顯減低。

14、　　結(jié)論：
　　1.實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示let-7a在前列腺癌組織和癌細(xì)胞中表達(dá)下降。
　　2.我們成功構(gòu)建了包含let-7a的表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-let-7a-GFP，轉(zhuǎn)染并成功篩選穩(wěn)定表達(dá)let-7a的前列腺癌細(xì)胞PC3-let-7a-GFP。
　　3.轉(zhuǎn)染let-7a后，PC3和LNCaP細(xì)胞生長(zhǎng)和克隆形成能力受到明顯抑制，細(xì)胞周期分析發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)G1/S期阻滯。
　　4.雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)let-