PSMA及PSMA5在前列腺癌細(xì)胞中作用的研究.pdf

1、[研究背景]： 前列腺癌是男性最常見的惡性腫瘤之一，死亡率高居男性癌性死亡的第二位。發(fā)病隱匿和易轉(zhuǎn)移是臨床診斷和治療前列腺癌的最大障礙。目前前列腺癌的病因尚不明確，可能與遺傳、環(huán)境和性激素等多因素有關(guān)。前列腺癌特異膜標(biāo)志物是實(shí)現(xiàn)生物診斷和生物治療的基礎(chǔ)，探索前列腺癌特異膜標(biāo)志物在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制十分重要。 前列腺特異膜抗原(prostate-specific membrane antigen，PSMA)主要表

2、達(dá)于前列腺上皮細(xì)胞膜表面，具有較高的前列腺癌特異性和膜結(jié)合特性，是近年來前列腺癌研究熱點(diǎn)之一。PSMA是一種Ⅱ型跨膜糖蛋白，具有葉酸水解酶活性和NAALADase酶活性。PSMA在正常前列腺中低表達(dá)，在大多數(shù)前列腺癌組織中高表達(dá)，并隨腫瘤進(jìn)展而表達(dá)增高，在轉(zhuǎn)移癌及激素不敏感型前列腺癌中表達(dá)進(jìn)一步增高，提示PSMA可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，但PSMA在前列腺癌中的具體作用及機(jī)制尚不明了。相關(guān)研究提示PSMA可能與前列腺癌的生長侵襲有關(guān)。

3、 選擇剪接是轉(zhuǎn)錄后修飾的一個普遍現(xiàn)象，是產(chǎn)生蛋白質(zhì)多樣化的重要機(jī)制之一，與人類多種疾病包括腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。PSMA也存在多種選擇剪接形式。PSMA5是本課題組近期發(fā)現(xiàn)的PSMA新型剪接變異體，具有較高的前列腺癌特異性，不僅在基因結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)組成上與PSMA存在明顯差異，而且在前列腺病變特異性上也與PSMA不同，兩者是否在功能上也不一致還有待于進(jìn)一步實(shí)驗加以證實(shí)。 [目的]： 1.驗證PSMA新型剪接變異體

4、(PSMA5)能否表達(dá)完整的功能蛋白。 2.研究PSMA及PSMA5對前列腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為影響，比較二者有無差異，為PSMA及其剪接變異體的功能研究提供技術(shù)方法和物質(zhì)基礎(chǔ)，為進(jìn)一步研究PSMA及其剪接變異體在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制中的作用提供新的視野。 [方法]： 1.本研究在前期工作基礎(chǔ)上，以本實(shí)驗室保存的pMD18T-PSMA和pMD18T-PSMA5質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增分別包含PSMA和PSMA5的完

5、整開放讀碼框架的目的基因片段，構(gòu)建兩個真核表達(dá)載體pcDNA3.0/PSMA和pcDNA3.0/PSMA5，經(jīng)雙酶切和堿基測序鑒定。 2.將鑒定陽性的pcDNA3.0-PSMA和lpcDNA3.0-PSMA5分別轉(zhuǎn)染模型細(xì)胞PC-3，轉(zhuǎn)染pcDNA3.0空質(zhì)粒作為陰性對照。G418篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞，RF-PCR、間接免疫熒光和免疫印跡分別從基因水平和蛋白水平鑒定G418抗性細(xì)胞中有無目的蛋白表達(dá)。 3.利甩PSMA和PSMA

6、5蛋白表達(dá)陽性的PC-3細(xì)胞進(jìn)行體外功能實(shí)驗，包括繪制生長曲線、劃痕實(shí)驗、侵襲實(shí)驗，比較空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染前后、重組質(zhì)粒組與空質(zhì)粒組及PSMA/PC-3和PSMA5/PC-3對PC-3細(xì)胞的生物學(xué)行為影響有無差異。 [結(jié)果]： 1.測序結(jié)果表明目的片段在pcDNA3.0質(zhì)粒中插入方向正確，序列與模板100﹪同源，說明pcDNA3.0-PSMA及pcDNA3.0-PSMA5真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。 2.篩選出的G418抗性細(xì)

7、胞克隆擴(kuò)增后，RT-PCR鑒定結(jié)果：PSMA及PSMA5特異性引物分別可從PSMA/PC-3細(xì)胞和：PSMA5/PC-3細(xì)胞來源的cDNA中擴(kuò)出目的片段，而以pcDNA3.0/PC-3細(xì)胞來源的cDNA為模板只能擴(kuò)出內(nèi)參，無其他條帶擴(kuò)出。說明PSMA和PSMA5在基因水平上有轉(zhuǎn)錄。免疫熒光結(jié)果：PSMA/PC-3、PSMA5/PC-3細(xì)胞均發(fā)出綠色熒光；免疫印跡結(jié)果：裂解兩種細(xì)胞提取的蛋白和PSMA單抗結(jié)合可顯示較弱條帶，與陽性對照LN

8、CaP細(xì)胞的目的蛋白條帶位置相同或接近，說明重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的PC-3細(xì)胞均有目的蛋白表達(dá)。 3.各組功能實(shí)驗均以空質(zhì)粒組為對照組，PSMA5/PC-3和PSMA/PC-3有生長減慢的趨勢，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)；PSMA/PC-3和PSMA5/PC-3的遷移速率相當(dāng)，均慢于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；侵襲實(shí)驗中PSMA/PC-3細(xì)胞的過膜細(xì)胞數(shù)最少，與空質(zhì)粒對照組和IPSMA5/PC-3相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，PSMA

9、5/PC-3細(xì)胞的過膜細(xì)胞數(shù)比空質(zhì)粒組細(xì)胞少，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)。 [結(jié)論]： 1.成功構(gòu)建了pcDNA3.0-PSMA和pcDNA3.0-PSMA5兩個真核表達(dá)載體，獲得PSMA和PSMA5表達(dá)陽性的PC-3細(xì)胞株，為相關(guān)功能實(shí)驗提供物質(zhì)基礎(chǔ)。 2.證實(shí)PSMA5可在真核細(xì)胞表達(dá)膜蛋白，并具有良好的抗原性。 3.PSMA可抑制前列腺癌細(xì)胞PC-3的侵襲和遷移，PSMA5可抑制PC-3細(xì)胞的