LAMA4及相關(guān)lncRNA在前列腺癌組織中的差異表達(dá),以及其對(duì)前列腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力影響的研究.pdf

1、目的：
　　利用微陣列基因芯片技術(shù)檢測(cè)前列腺癌（PCa）、和癌旁正常組織中差異表達(dá)的mRNA和lncRNA。觀察前列腺癌與癌旁正常組織基因表達(dá)的變化，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)LAMA4基因及其相應(yīng)lncRNA，為前列腺癌轉(zhuǎn)移提供分子層面的新證據(jù)，以期為臨床前列腺癌的預(yù)防、診療，以及發(fā)病機(jī)制提供新理論及新方案。
　　方法：
　　收集2013年8月至2014年8月我院前列腺切除術(shù)后臨床組織標(biāo)本共20例，通過(guò)改進(jìn)標(biāo)本獲取方式，運(yùn)輸途徑，破碎

2、方法三方面因素，建立從離體組織標(biāo)本提取高質(zhì)量總RNA的方法。隨后在此方法基礎(chǔ)上，通過(guò)冰凍切片結(jié)合手工顯微切割技術(shù)在同一前列腺組織標(biāo)本中分離出PCa、癌旁正常組織各區(qū)域的純凈細(xì)胞群。采用lncRNA+mRNA表達(dá)譜芯片分析三者間的基因表達(dá)差異（生物學(xué)重復(fù)3次），通過(guò)生物信息學(xué)的方法篩選出具有顯著表達(dá)差異的mRNA和lncRNA，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行Pathway分析等初步的生物信息學(xué)分析，反向Cis-預(yù)測(cè)lncRNA的靶基因，在發(fā)生顯著變化的炎癥

3、和/或癌癥通路上建立lncRNA與靶基因的基因網(wǎng)絡(luò)圖。確定LAMA4及其相關(guān)lncRNA的差異表達(dá)，并通過(guò)收取2014年11月至2015年10月我院前列腺切除術(shù)后臨床組織標(biāo)本6例，進(jìn)行組織標(biāo)本PCR驗(yàn)證，培養(yǎng)DU145前列腺癌細(xì)胞系，22RV1前列腺癌細(xì)胞系，使用特異性siRNA，以LipofectamineTM2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，進(jìn)一步采取qRT-PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果，以確定是否轉(zhuǎn)染成功。對(duì)于轉(zhuǎn)染后抑制的細(xì)胞，通過(guò)transwell，劃痕

4、實(shí)驗(yàn)以及MTT法細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的遷移，轉(zhuǎn)移，黏附探尋lncRNA在此過(guò)程中的作用。
　　結(jié)果：
　　1.基因表達(dá)譜芯片的結(jié)果顯示：人前列腺癌組織與癌旁正常組織對(duì)照相比，有2610個(gè)mRNA表達(dá)有差異，其中上調(diào)689個(gè)，下調(diào)1921個(gè)；同時(shí)有2176個(gè)lncRNA表達(dá)有差異，其中上調(diào)688個(gè)，下調(diào)1488個(gè)。人前列腺增生性炎性萎縮組織與癌旁正常組織相比，有592個(gè)mRNA表達(dá)有差異，其中上調(diào)183個(gè)，下調(diào)409個(gè)；

5、同時(shí)有575個(gè)lncRNA表達(dá)有差異，其中上調(diào)160個(gè)，下調(diào)415個(gè)。人前列腺癌組織與前列腺增生性炎性萎縮組織相比，有1007個(gè)mRNA表達(dá)有差異，其中上調(diào)115個(gè)，下調(diào)892個(gè)；有773個(gè)lncRNA表達(dá)有差異，其中上調(diào)105個(gè)，下調(diào)668個(gè)。在3種組織類型的共同比較中，有113個(gè)mRNA的表達(dá)存在顯著線性差異，其中上調(diào)8個(gè)，下調(diào)105個(gè)；有106個(gè)lncRNA的表達(dá)也存在顯著線性差異，其中上調(diào)11個(gè)，下調(diào)95個(gè)。
　　2.LA

6、MA4基因的mRNA及其lncRNA在芯片結(jié)果中差異表達(dá)明顯，在組織標(biāo)本中，組織PCR結(jié)果符合芯片結(jié)果。
　　3.轉(zhuǎn)染后細(xì)胞PCR顯示，siRNA敲底lncRNA和LAMA4mRNA水平
　　4.細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞遷移轉(zhuǎn)移能力明顯減弱。
　　結(jié)論：
　　1.冰凍切片并H&E染色結(jié)合“排除法”手工顯微切割技術(shù)，可經(jīng)濟(jì)、有效地鑒定分離出目的細(xì)胞亞群，且通過(guò)Trizol法提取的總RNA能夠滿足高通量微陣列技