Exosomal microRNA在前列腺癌臨床診斷中的作用.pdf

1、前列腺癌是男性泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，但目前缺乏敏感性和特異性俱佳的生物標(biāo)志物，尋找一種理想的腫瘤生物標(biāo)志物是當(dāng)前前列腺癌臨床和基礎(chǔ)研究中備受關(guān)注的課題。Exosomes是細(xì)胞分泌到循環(huán)血液和體液中的一類包含特定蛋白質(zhì)、mRNA和microRNA(miRNA)等信號(hào)分子的小囊泡。最新研究表明，miRNA能夠被主動(dòng)選擇性地包裹進(jìn)Exosomes，并參與細(xì)胞間信息傳遞及通訊，其表達(dá)變化可以特異地反映機(jī)體某些生理病理狀態(tài)的動(dòng)態(tài)變化和轉(zhuǎn)歸，在

2、腫瘤發(fā)生發(fā)展中有望成為良好的腫瘤特異性分子標(biāo)志物，而且循環(huán)血液和體液中Exosomes的相關(guān)檢測(cè)具備無(wú)創(chuàng)、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。因此，體液中的Exosomal miRNA分子標(biāo)志物在腫瘤臨床診斷和預(yù)后評(píng)估等方面具有良好的應(yīng)用前景?；诖耍瑸榱颂接慐xosomal miRNA在前列腺癌臨床診斷中的作用，我們進(jìn)行了以下三部分研究：
　　第一部分前列腺癌血清Exosomes的分離、鑒定及其生物學(xué)特性
　　目的：建立穩(wěn)定的血清Exosomes

3、分離方法并進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子表型鑒定，探討前列腺癌Exosomes的生物學(xué)特性。
　　方法：采用ExoQuick沉淀試劑分離血清Exosomes，用透射電鏡和NanoSight分析儀，以及Western blot和流式細(xì)胞術(shù)分別進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子表型鑒定。將來自前列腺癌患者混合血清的Exosomes與正?；|(zhì)細(xì)胞WPMY-1共培養(yǎng)，用激光共聚焦顯微鏡觀察前列腺癌Exosomes在受體細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)；分別采用CCK-8法、Transwel

4、l侵襲實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)前列腺癌血清Exosomes對(duì)WPMY-1細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力的影響。
　　結(jié)果：
　　1、血清Exosomes的提取和鑒定：采用ExoQuick從人血清中分離到的沉淀物，顆粒直徑約為30~100nm，最大分布峰值為58nm，能夠表達(dá)特征性蛋白HSP70和CD63，符合Exosomes的主要特征。
　　2、前列腺癌血清Exosomes的生物學(xué)特性：經(jīng)過24h共培養(yǎng)，激光共聚焦顯微鏡觀察到前列

5、腺癌血清 Exosomes能夠穿過細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)到受體細(xì)胞中，且轉(zhuǎn)運(yùn)量與Exosomes的初始濃度相關(guān)；前列腺癌血清Exosomes可以使正常前列腺基質(zhì)細(xì)胞WPMY-1的增殖能力顯著提高，且與作用時(shí)間和Exosomes的作用濃度成正比；此外，前列腺癌Exosomes能夠促使正?；|(zhì)細(xì)胞的侵襲能力和遷移能力顯著增強(qiáng)。
　　結(jié)論：采用ExoQuick沉淀試劑從血清中可以穩(wěn)定分離出Exosomes，前列腺癌血清Exosomes能促使正?；|(zhì)

6、細(xì)胞表現(xiàn)出顯著的增殖、侵襲和遷移能力，提示其可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，很有必要進(jìn)一步探討其在腫瘤臨床診療中的價(jià)值。
　　第二部分Exosomal miRNA檢測(cè)在前列腺癌診斷中的價(jià)值
　　目的：研究Exosomes在前列腺癌循環(huán)miRNA檢測(cè)中的價(jià)值。
　　方法：采用ExoQuick沉淀試劑分離Exosomes，提取RNA，并用Agilent2200生物分析儀進(jìn)行質(zhì)量分析。采用qRT-PCR法檢測(cè)miRNA的相對(duì)表

7、達(dá)量。
　　結(jié)果：
　　1、Exosomal RNA的分布及其特點(diǎn)：Agilent2200生物分析儀檢測(cè)結(jié)果提示血清Exosomes中富含小 RNA。10例健康人群血清 Exosomes中均可檢出4種常見miRNA（miR-21，miR-16，miR-20a和let-7a），且其相對(duì)表達(dá)量顯著高于全血清樣本和去除Exosome后的上清液。
　　2、Exosomes在前列腺癌血清循環(huán)miRNA檢測(cè)中的價(jià)值：血清Exoso

8、mes中的miR-141表達(dá)水平顯著高于血清游離miR-141，且二者顯著相關(guān)，PCa組的Exosomal miR-141含量顯著高于BPH組和正常對(duì)照人群；qRT-PCR檢測(cè)51例PCa患者和40例正常對(duì)照人群的血清Exosomal miR-141表達(dá)水平，結(jié)果表明PCa組的Exosomal miR-141表達(dá)水平顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.0001），且與腫瘤臨床病理特征有不同程度的相關(guān)性。采用Exosomal miR-141判斷轉(zhuǎn)

9、移性前列腺癌的ROC曲線下面積（AUC）為0.8694，檢測(cè)敏感性和特異性分別為80％和87.10%。
　　3、前列腺癌患者尿液Exosomal miRNA的初步檢測(cè)：在血清學(xué)研究的基礎(chǔ)上，我們對(duì)10例前列腺癌患者的尿液樣本進(jìn)行了探索性研究。結(jié)果顯示，所有患者尿液Exosomes樣本中均可不同程度地檢出 miR-141，但總體表達(dá)水平與對(duì)照組之間未見顯著性差異（P=0.0992）。
　　結(jié)論：分離血清Exosomes有利于提

10、高某些循環(huán)miRNA的檢測(cè)敏感性，尿液Exosomes中也可以檢測(cè)到miRNA，這就為前列腺癌Exosomal miRNA標(biāo)志物的研究提供了新的思路和可能性。
　　第三部分前列腺癌尿液Exosomal miRNA差異表達(dá)譜的測(cè)序篩選
　　目的：測(cè)序篩選前列腺癌患者尿液Exosomal miRNA差異表達(dá)譜。
　　方法：選取轉(zhuǎn)移性前列腺癌、局限性前列腺癌和健康男性各3例，留取晨尿。采用ExoQuick-TC沉淀試劑分離尿

11、液Exosomes，提取RNA并采用Agilent2200生物分析儀進(jìn)行質(zhì)檢，構(gòu)建cDNA文庫(kù)，采用Illumina HiSeqTM2500平臺(tái)進(jìn)行小RNA序列測(cè)定。將測(cè)序數(shù)據(jù)與miRBase21.0數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，計(jì)算各樣本的miRNA表達(dá)量并進(jìn)行組間差異分析，篩選出前列腺癌的尿液Exosomal miRNA差異表達(dá)譜。對(duì)存在顯著性差異的基因進(jìn)行qRT-PCR初步驗(yàn)證。
　　結(jié)果：經(jīng)過深度測(cè)序，尿液Exosomes中miRNA的

12、平均含量為（8.10±0.03）%，各樣本間未見顯著差異。通過組間比對(duì)，發(fā)現(xiàn)Exosomal miR-375差異最為顯著，在正常對(duì)照、局限癌和轉(zhuǎn)移癌組中呈漸進(jìn)性低表達(dá)，采用20例前列腺癌尿液樣本對(duì)其進(jìn)行qRT-PCR初步驗(yàn)證，所得結(jié)果與測(cè)序一致。此外，另有22個(gè)miRNA在前列腺癌中出現(xiàn)差異表達(dá)，其中10個(gè)呈漸進(jìn)性低表達(dá)（miR-664a-5p，miR-200b-5p，miR-30a-5p， miR-30a-3p，miR-200c-3p

13、，miR-151a-3p，miR-532-5p，miR-361-3p，miR-30d-5p， miR-148-3p），12個(gè)呈漸進(jìn)性高表達(dá)（miR-126-5p，miR-3656，miR-199a-5p，miR-4508，miR-9-5p，miR-1-3p，miR-126-3p，miR-199a-3p，miR-4497，miR-1273g-3p，miR-4532， miR-3960）。
　　結(jié)論：通過深度測(cè)序，初步篩選出包括miR