攜載PSMA納米抗體的超聲納米泡在靶向診斷前列腺癌中的實驗研究.pdf

1、背景:
　　前列腺癌已成為嚴(yán)重威脅老年男性健康的惡性腫瘤之一,在我國隨著前列腺特異性抗原(prostate specific antigen, PSA)的篩查普及和居民生活習(xí)慣的改變而導(dǎo)致其檢出率不斷增加。前列腺癌的早期診斷對于病人的預(yù)后具有重要意義,但是目前的影像學(xué)技術(shù)對早期前列腺癌的診斷存在靈敏度不高、特異性不強(qiáng)等問題。分子影像學(xué)的出現(xiàn)能夠在病變發(fā)生解剖結(jié)構(gòu)改變之前發(fā)現(xiàn)功能變化,對傳統(tǒng)影像學(xué)是一種有效的補(bǔ)充。結(jié)合超聲檢查技術(shù)的

2、方便快捷、實時性好和安全無輻射的特點,超聲造影技術(shù)(contrast-enhanced ultrasound, CEUS)能夠提高前列腺癌的早期診斷。超聲納米泡是一種粒徑小、穩(wěn)定性好和穿透能力強(qiáng)的一種造影劑,能夠利用腫瘤增強(qiáng)的滲透和滯留效應(yīng)(enhanced permeability and retention effect, EPR)即基底膜不完整、腫瘤新生血管內(nèi)皮間隙增寬和周圍淋巴回流不暢的特性穿過腫瘤血管,實現(xiàn)腫瘤實質(zhì)的顯像。而前

3、列腺特異性膜抗原(prostate specific membrane antigen, PSMA)是一種相比于PSA更為特異的前列腺癌標(biāo)記物,在細(xì)胞膜上表達(dá)的特性使其成為一種重要的靶點,廣泛的應(yīng)用于前列腺癌的靶向診斷和治療研究中。前期我們課題組發(fā)現(xiàn)攜帶PSMA單克隆抗體的納米泡在前列腺癌中能夠?qū)崿F(xiàn)靶向顯像的目的,但是同時也發(fā)現(xiàn),前期由于制備的靶向納米泡粒徑較大,可能在一定程度上影響納米泡的穿透性能,因此我們尋求一種新的靶向 PSMA的

4、物質(zhì)。而納米抗體是首先發(fā)現(xiàn)在駱駝體內(nèi)的缺失輕鏈和 CH1區(qū)的重鏈抗體的可變區(qū),具有極強(qiáng)的穩(wěn)定性、分子量小和免疫原性低等眾多特點。因此,我們期望構(gòu)建攜載PSMA納米抗體的納米泡,同時能夠利用腫瘤的EPR效應(yīng)實現(xiàn)前列腺癌的特異性超聲分子顯像,為前列腺癌的診斷、療效監(jiān)測及預(yù)后評價提供有效手段。
　　目的:
　　在非免疫性納米抗體噬菌體展示庫中淘選得到特異性的PSMA納米抗體,通過生物素-鏈霉親和素方法將其與制備的生物素化納米泡相連

5、接構(gòu)建靶向納米泡;為進(jìn)一步對比分析納米泡和微米泡在穿透力方面的區(qū)別,我們通過數(shù)據(jù)分析和形態(tài)學(xué)觀察證明在動物體內(nèi)納米泡能夠通過腫瘤血管這一現(xiàn)象;在此基礎(chǔ)上,研究靶向納米泡與前列腺癌細(xì)胞特異性結(jié)合的能力,并探討其在前列腺癌移植瘤中靶向顯像的效果。
　　方法:
　　1.在真核細(xì)胞中利用 RT-PCR技術(shù)重組表達(dá) PSMA的胞外區(qū);其后,利用固相淘選方法在非免疫的納米抗體噬菌體庫中經(jīng)過四輪淘選得到與該重組蛋白特異性結(jié)合的噬菌體,隨后

6、在細(xì)胞水平采用細(xì)胞酶聯(lián)免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)以及細(xì)胞免疫熒光驗證陽性噬菌體克隆的細(xì)胞特異性;在原核生物中重組表達(dá)該克隆攜載的納米抗體片段,進(jìn)行生物素化修飾后,采用細(xì)胞ELISA與前期研究中使用的生物素化單克隆抗體進(jìn)行親和能力的比較。
　　2.冷凍干燥法制備脂質(zhì)納米泡并檢測其物理特性;使用超聲診斷儀iu22上L12-5探頭在體外瓊脂糖模型和裸鼠胃癌移植瘤上研究納米

7、泡和微米泡(SonoVueR)的成像效果,體內(nèi)采用的具體造影指標(biāo)包括起始顯像時間、達(dá)峰時間、峰值強(qiáng)度和顯像持續(xù)時間;通過心臟灌注的方法排除血管中脂質(zhì)納米泡的影響,利用超聲爆破技術(shù)和組織冰凍切片技術(shù)從數(shù)據(jù)和形態(tài)學(xué)角度分別研究納米泡在活體和離體的裸鼠胃癌移植瘤組織中的分布情況;使用透射電鏡驗證納米泡在移植瘤中進(jìn)入組織間隙的情況。
　　3.蛋白免疫印跡技術(shù)(Western blot)檢測三種細(xì)胞(LNCaP、C4-2和 MKN45)中P

8、SMA的表達(dá)情況;利用生物素-鏈霉親和素方法構(gòu)建靶向納米泡,并使用免疫熒光方法對其是否構(gòu)建成功進(jìn)行驗證并與前期制備攜載單克隆抗體的靶向納米泡進(jìn)行比較;在顯微鏡下觀察納米泡對細(xì)胞的靶向情況,以納米泡個數(shù)/細(xì)胞和黏附率(靶向納米泡數(shù)≥4個/細(xì)胞的細(xì)胞百分比)表示;采用超聲造影技術(shù)觀察靶向納米泡在三種動物移植瘤(LNCaP、C4-2和MKN45)中的顯影情況,統(tǒng)計分析四種超聲造影指標(biāo)包括起始顯影時間、達(dá)峰時間、峰值強(qiáng)度和顯影持續(xù)時間。

9、　　結(jié)果:
　　1.測序結(jié)果表明編碼PSMA膜外區(qū)的DNA片段序列正確,western blot表明該蛋白能夠成功與其單克隆抗體進(jìn)行結(jié)合;固相淘選方法從天然非免疫庫中有效富集了噬菌體克隆,使其陽性率從第一輪淘選后的8.3％提高到第四輪淘選后的64.6%。細(xì)胞ELISA結(jié)果為PSMA表達(dá)陽性細(xì)胞LNCaP的OD450值為(0.62±0.04),PSMA表達(dá)陰性的細(xì)胞MKN45的OD450值為(0.15±0.01),兩者具有顯著的統(tǒng)計

10、學(xué)差異(P<0.01);免疫熒光亦表明得到的陽性噬菌體克隆能夠與 LNCaP細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合,而不能與MKN45細(xì)胞發(fā)生結(jié)合。通過細(xì)胞ELISA檢測生物素化納米抗體與前期生物素化單克隆抗體對細(xì)胞的親和力相當(dāng)。
　　2.制備的脂質(zhì)納米泡粒徑為(435.20±60.53)nm;納米泡在體外不同濃度的顯影效果強(qiáng)于SonoVueR,且具有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異;體內(nèi)的四項造影指標(biāo):開始顯像時間、達(dá)峰時間、峰值強(qiáng)度和顯像持續(xù)時間均長于或者高于

11、SonoVueR的對應(yīng)指標(biāo),具有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異(P值均小于0.01);心臟灌注法排除血管中存留納米泡的影響后,首次超聲爆破與后續(xù)爆破產(chǎn)生的超聲信號強(qiáng)度統(tǒng)計學(xué)分析表明80%(4/5)能檢測出納米泡的存在;冰凍切片技術(shù)表明納米泡能夠穿過腫瘤血管的內(nèi)皮細(xì)胞間隙進(jìn)入組織間隙,同時透射電鏡亦證實納米泡能夠穿過新生的血管內(nèi)皮間隙。
　　3.Western blot實驗表明,PSMA蛋白在LNCaP細(xì)胞中的表達(dá)量最高,C4-2細(xì)胞次之,MKN

12、45細(xì)胞不表達(dá)。通過細(xì)胞ELISA發(fā)現(xiàn)原核生物表達(dá)的納米抗體經(jīng)生物素化修飾后,能夠與PSMA表達(dá)陽性的LNCaP細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合。通過生物素-鏈霉親和素方法構(gòu)建的靶向納米泡的粒徑為(487.60±33.55)nm,明顯小于前期攜載單克隆抗體的靶向納米泡的粒徑(644.30±55.85) nm,熒光免疫實驗證明了該納米泡能夠攜帶生物素化的納米抗體;細(xì)胞實驗表明靶向納米泡能夠與 LNCaP細(xì)胞、C4-2細(xì)胞發(fā)生結(jié)合,黏附率達(dá)90%以上,與

13、MKN45細(xì)胞未發(fā)生明顯結(jié)合;移植瘤體內(nèi)的超聲造影結(jié)果表明:在LNCaP和C4-2移植瘤中,靶向納米泡的峰值強(qiáng)度和顯影持續(xù)時間與空白納米泡有明顯差異(P<0.01);與 MKN45移植瘤相比,C4-2移植瘤4種指標(biāo)均有差異(P<0.05),而LNCaP移植瘤中的起始顯影時間、峰值強(qiáng)度有明顯差異(P<0.01)。
　　結(jié)論:
　　1.成功制備了 PSMA的胞外區(qū)蛋白,從非免疫納米抗體噬菌體展示庫中淘選得到了能與PSMA特異性結(jié)

14、合的納米抗體并進(jìn)行了細(xì)胞水平的驗證。同時,通過與前期生物素化的單克隆抗體比較證實了抗PSMA納米抗體對前列腺癌細(xì)胞具有較好的親和能力。
　　2.脂質(zhì)納米泡的體內(nèi)體外顯影效果均優(yōu)于微米泡SonoVueR,且能夠穿過腫瘤新生血管內(nèi)皮間隙,為腫瘤血管外超聲顯像提供了形態(tài)學(xué)依據(jù),亦為納米泡在腫瘤血管外靶向超聲診斷和超聲輔助治療中的應(yīng)用提供了實驗依據(jù)。
　　3.構(gòu)建的攜載 PSMA納米抗體的靶向納米泡,能夠在體外特異性地與前列腺癌細(xì)胞