靶向于前列腺癌的載阿霉素納米泡的構(gòu)建及其體外治療效能評(píng)估.pdf

1、目前，前列腺癌發(fā)展成為我國(guó)男性高發(fā)的惡性腫瘤。雖然大部分前列腺癌對(duì)抗雄激素治療都有效，但是絕大多數(shù)會(huì)在雄激素治療過程中發(fā)展為雄激素非依賴性前列腺癌(androgenic independent prostate cancer，AIPC)。而目前針對(duì)AIPC的治療方法和手段較少。相關(guān)研究顯示，由于腫瘤新生血管基底膜不完整，內(nèi)皮間隙寬，納米級(jí)超聲造影劑微泡的粒徑小，能穿過腫瘤血管，達(dá)到腫瘤實(shí)質(zhì)，實(shí)現(xiàn)腫瘤組織特異性分子顯像。前列腺特異性膜抗原

2、(prostate specific membrane antigen，PSMA)是前列腺癌細(xì)胞膜抗原，尤其常表達(dá)于前列腺轉(zhuǎn)移性癌和AIPC中，已經(jīng)成為前列腺癌的靶向診斷和治療研究的熱點(diǎn)。廣譜抗腫瘤藥物阿霉素(doxorubicin，DOX)有良好的殺傷腫瘤細(xì)胞的作用，但對(duì)正常細(xì)胞也有強(qiáng)烈的細(xì)胞毒性，對(duì)機(jī)體有明顯的毒副作用。如何在降低阿霉素副作用的情況下達(dá)到有效治療腫瘤的作用一直是目前腫瘤靶向治療研究的難點(diǎn)。前期已制備出攜帶PSMA單克

3、隆抗體的納米級(jí)超聲造影劑，且在能前列腺癌中靶向特異性顯像。因此，本研究擬結(jié)合前期的研究結(jié)果及相關(guān)研究進(jìn)展，構(gòu)建一種攜載PSMA單克隆抗體的載阿霉素納米泡，在實(shí)現(xiàn)前列腺癌的特異性超聲分子顯像的同時(shí)，用超聲波擊破靶向載藥納米泡，釋放出阿霉素，使阿霉素在腫瘤局部組織內(nèi)濃度增高，達(dá)到靶向治療前列腺癌的目的，為前列腺癌的診斷治療提供一種新的思路和方法。
　　目的
　　制備靶向于前列腺癌的攜載PSMA單克隆抗體的載阿霉素納米泡，觀察靶向

4、載藥納米泡的基本特性和與前列腺癌AIPC細(xì)胞靶向結(jié)合的能力，對(duì)其體內(nèi)顯像能力和體外對(duì)前列腺癌細(xì)胞殺傷的效果及其機(jī)制進(jìn)行研究和評(píng)估。
　　材料和方法
　　應(yīng)用機(jī)械震蕩法制備載阿霉素的納米泡，利用生物素-鏈霉素法制備攜載PSMA單克隆抗體的載阿霉素納米泡。用熒光顯微鏡觀察納米泡和阿霉素連接情況，用熒光顯微鏡觀察納米泡和PSMA單克隆抗體偶聯(lián)的情況。用光鏡和透射電鏡觀察靶向載藥納米泡形態(tài)大小。用粒徑檢測(cè)儀檢測(cè)其粒徑和電位。用酶標(biāo)儀

5、檢測(cè)其載阿霉素濃度。在超聲治療儀不同輻照強(qiáng)度和時(shí)間條件下輻照靶向載藥納米泡，探究最佳輻照強(qiáng)度和時(shí)間。在超聲波治療儀最適輻照條件下檢測(cè)其藥物釋放率。將靶向載藥納米泡與臨床用微米級(jí)聲學(xué)造影劑對(duì)比研究，觀察二者在小鼠肝臟和腎臟上的增強(qiáng)造影效果。最后用光鏡觀察靶向載藥納米泡與前列腺癌細(xì)胞的結(jié)合情況，在此基礎(chǔ)上研究靶向載藥納米泡在體外的治療效果，并在掃描電鏡下觀察超聲輻照后靶向載藥納米泡對(duì)前列腺癌細(xì)胞的作用。
　　結(jié)果
　　攜載PSM

6、A單克隆抗體的靶向載藥納米泡在光鏡下大小適中、分布均勻;載藥納米泡的脂質(zhì)外殼在熒光顯微鏡下顯示為阿霉素發(fā)出的紅色熒光;FITC標(biāo)記的二抗與靶向載藥納米泡結(jié)合后，靶向納米泡表面顯示為綠色熒光。靶向載藥納米泡平均粒徑為(793.80±92.05)nm，電位為(8.74±2.41)mV。酶標(biāo)儀測(cè)量納米泡載阿霉素的濃度為(1.18±0.11)mg/ml。超聲治療儀的最適輻照強(qiáng)度和時(shí)間為1.0 W/cm2和18s。在超聲波治療儀輻照下，阿霉素的釋

7、放率為(48.65±3.99)％。靶向載藥納米泡在小白鼠肝臟和腎臟顯影的達(dá)峰時(shí)間遲于微米級(jí)聲學(xué)造影劑、上升時(shí)間和持續(xù)顯影時(shí)間均長(zhǎng)于臨床用微米級(jí)聲學(xué)造影劑，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，而兩者的峰值強(qiáng)度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。靶向載藥納米泡可特異性地粘附在表達(dá)PSMA的前列腺癌C4-2細(xì)胞表面，與不表達(dá)PSMA的前列腺癌細(xì)胞PC-3和胃癌細(xì)胞MKN45不粘附結(jié)合。相同超聲輻照條件下，靶向載藥納米泡對(duì)C4-2細(xì)胞和PC-3細(xì)胞的殺滅

8、作用明顯強(qiáng)于單純藥物組、空白納米泡組、靶向納米泡組、空白組，但與載藥納米泡組差別不明顯。應(yīng)用掃描電鏡進(jìn)一步觀察到，超聲輻照靶向載藥納米泡組的C4-2細(xì)胞表面不平，有孔道生成，而超聲輻照單純C4-2組的細(xì)胞表面光滑，無孔道生成。
　　結(jié)論
　　本實(shí)驗(yàn)成功制備了性質(zhì)穩(wěn)定的攜載PSMA單克隆抗體載藥納米泡，且證實(shí)納米泡表面成功連接有PSMA單克隆抗體，阿霉素均勻分布在納米泡的脂質(zhì)外殼中。其在體內(nèi)有較好的顯影效果，且在體外實(shí)驗(yàn)中證實(shí)