MEPE蛋白影響前列腺癌細胞遷移作用機制研究.pdf

1、目的：研究細胞外基質(zhì)磷酸糖蛋白（MEPE）在前列腺癌細胞中的表達水平對前列腺癌細胞遷移能力的影響，以及MEPE蛋白影響細胞遷移能力的機制與小G蛋白家族蛋白PI3K/Rac1/PAK1通路的關(guān)系。為闡明腫瘤浸潤及轉(zhuǎn)移機制提供實驗依據(jù)。
　　方法：構(gòu)建腺病毒包裝質(zhì)粒pYr-ads-4-mMEPE與pYr-ads-4-siMEPE，在HEK293細胞中包裝形成腺病毒顆粒，分別轉(zhuǎn)染正常前列腺上皮細胞株RWPE1與前列腺癌細胞株P(guān)C3，同時

2、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒作為對照細胞株。免疫印跡檢測轉(zhuǎn)染細胞株中MEPE蛋白表達水平，確定轉(zhuǎn)染效果。通過經(jīng)典的劃痕實驗、Transwell侵襲/遷移實驗對比人為上調(diào)或下調(diào)MEPE蛋白表達水平的細胞株以及其對應(yīng)的空載體的細胞株之間侵襲/遷移能力的差異。進一步采用免疫印跡方法檢測MEPE蛋白表達水平不同的各個細胞株內(nèi)信號通路PI3K/Rac1/PAK1的信號蛋白表達水平是否也隨之改變。
　　結(jié)果：⑴經(jīng)酶切與測序驗證，pYr-ads-4-mMEPE與

3、pYr-ads-4-siMEPE重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，免疫印跡分析驗證轉(zhuǎn)染rAd-4-mMEPE的RWPE1細胞株中MEPE蛋白表達水平上調(diào)，轉(zhuǎn)染rAd-4-siMEPE的PC3細胞株中MEPE蛋白表達水平下調(diào)，而轉(zhuǎn)染相應(yīng)空載體的細胞株中MEPE蛋白的表達水平與野生型細胞株一致，說明腺病毒質(zhì)粒構(gòu)建成功可在真核細胞表達。⑵通過劃痕實驗分別在0h與48h觀察轉(zhuǎn)染rAd-4-mMEPE的RWPE1細胞株、轉(zhuǎn)染rAd-4-siMEPE的PC3細胞株

4、以及其對照細胞株細胞遷移情況，MEPE蛋白表達水平高的細胞株遷移率分別為83％、56%，空載體對照細胞遷移率為68%、79%，實驗結(jié)果表明MEPE蛋白表達水平高的細胞株細胞遷移能力明顯增強。⑶Transwell實驗觀察到轉(zhuǎn)染rAd-4-mMEPE的RWPE1細胞株遷移率比對照細胞株增加了15%，轉(zhuǎn)染rAd-4-siMEPE的PC3細胞株遷移率比對照細胞株下降了23%。實驗結(jié)果表明MEPE蛋白表達水平高的細胞株細胞遷移能力明顯增強。⑷免疫

5、印跡分析結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染rAd-4-mMEPE的RWPE1細胞株、轉(zhuǎn)染rAd-4-siMEPE的PC3細胞株以及其對照細胞株中PI3K與Rac1的信號蛋白表達水平也隨MEPE表達水平改變而改變。在RWPE1細胞中其中隨著MEPE蛋白表達水平增高，PI3K與Rac1表達水平也升高，在MEPE蛋白表達水平較低的轉(zhuǎn)染rAd-4-siMEPE的PC3細胞株與轉(zhuǎn)染空載體的RWPE1細胞株中，PI3K與Rac1表達水平較低，actin的表達水平未見明