細胞遷移誘導蛋白在前列腺癌失巢凋亡耐受細胞轉(zhuǎn)移和代謝中的作用研究.pdf

1、本文分為以下幾個部分:
　　第一部分:前列腺癌失巢凋亡耐受細胞模型的建立及生物學行為研究
　　目的：建立前列腺癌細胞失巢凋亡耐受模型并探究其失巢凋亡抵抗、遷移、侵襲、代謝相關(guān)生物學行為。
　　方法：應用超低粘附培養(yǎng)板持續(xù)懸浮培養(yǎng)前列腺癌PC-3細胞和DU145細胞7天，然后將細胞轉(zhuǎn)移至普通培養(yǎng)板繼續(xù)培養(yǎng)2天，能夠存活并貼壁生長的細胞即認為是失巢凋亡耐受細胞。采用FITC/PI流式細胞術(shù)檢測PC-3、DU145親本細胞和

2、失巢凋亡耐受細胞在懸浮培養(yǎng)48小時的凋亡水平。采用Transwell法檢測PC-3、DU145親本細胞和失巢凋亡耐受細胞的遷移和侵襲能力。應用生化檢測試劑盒檢測PC-3、DU145親本細胞和失巢凋亡耐受細胞丙酮酸、乳酸和ATP水平。應用蛋白質(zhì)免疫印跡實驗檢測PC-3、DU145親本細胞和失巢凋亡耐受細胞轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白金屬基質(zhì)蛋白酶2（MMP2）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）以及代謝相關(guān)蛋白丙酮酸脫氫酶激酶4（PDK4）、乳酸脫氫酶A（LD

3、HA）的表達情況。
　　結(jié)果：FITC/PI流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，失巢凋亡耐受的PC-3和DU145細胞在懸浮培養(yǎng)48小時后的凋亡率較各自的親本細胞明顯降低。Transwell細胞遷移實驗結(jié)果顯示，失巢凋亡耐受的PC-3和DU145細胞在遷移數(shù)量上較相應的親本細胞明顯增加；Transwell侵襲實驗結(jié)果表明，失巢凋亡耐受的PC-3和DU145細胞的侵襲能力較各自的親本細胞明顯增強。生化檢測結(jié)果顯示，失巢凋亡耐受的PC-3和DU1

4、45細胞的丙酮酸、乳酸和ATP水平較各自的親本細胞明顯升高。蛋白質(zhì)免疫印跡實驗結(jié)果顯示，失巢凋亡耐受的PC-3和DU145細胞轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白MMP2、VEGF及代謝相關(guān)蛋白PDK4、LDHA表達水平較各自的親本細胞明顯增加。
　　結(jié)論：失巢凋亡耐受的前列腺癌細胞較親本細胞的抗失巢凋亡能力和遷移侵襲能力明顯增強，可能與失巢凋亡耐受細胞MMP2和VEGF表達升高有關(guān)。失巢凋亡耐受的前列腺癌細胞較親本細胞出現(xiàn)更明顯的代謝重編程現(xiàn)象，表現(xiàn)為

5、細胞的丙酮酸、乳酸和ATP水平顯著上升，可能與失巢凋亡耐受細胞PDK4和LDHA表達升高有關(guān)。
　　第二部分:前列腺癌細胞失巢凋亡耐受過程中細胞遷移誘導蛋白的篩選與驗證
　　目的：篩選并驗證在前列腺癌細胞失巢凋亡耐受過程中與細胞轉(zhuǎn)移和能量代謝相關(guān)的潛在分子靶點。
　　方法：應用人類全基因組表達譜芯片技術(shù)發(fā)掘在前列腺癌親本和失巢凋亡耐受的PC-3細胞中表達具有顯著差異的基因，結(jié)合差異基因GO富集分析、KEGG通路富集分析

6、篩選出10個候選基因進行定量PCR驗證，并結(jié)合文獻報道確定目標基因，用蛋白質(zhì)免疫印跡實驗驗證其在親本和失巢凋亡耐受的PC-3與DU145細胞中的蛋白表達情況。最后用免疫組織化學技術(shù)分析含有90對接受根治性前列腺切除術(shù)患者的腫瘤和癌旁組織標本的組織芯片中目標基因的表達情況，分析其與前列腺癌臨床進展的關(guān)系。
　　結(jié)果：人類全基因組表達譜芯片分析結(jié)果顯示在前列腺癌親本與失巢凋亡耐受的PC-3細胞中共有2370個顯著差異表達基因，其中11

7、83個基因表達顯著上調(diào)，1187個基因表達顯著下調(diào)。定量PCR結(jié)果證實在失巢凋亡耐受的PC-3細胞中CYB5R2、SERPINE2、CEMIP、CCL2、ETV5等5個基因表達上調(diào)，而LGSN、ENPP1、SORBS2、DCN、CSPG4等5個基因表達下調(diào)。蛋白質(zhì)免疫印跡實驗結(jié)果亦表明在失巢凋亡耐受的PC-3和DU145細胞中細胞遷移誘導蛋白（CEMIP）及其上游β連環(huán)蛋白（β-catenin）表達均顯著升高。組織芯片結(jié)果顯示，CEMI

8、P在前列腺腫瘤組織中的表達較癌旁組織明顯增加且二者具有相關(guān)性。
　　結(jié)論：CEMIP在前列腺癌失巢凋亡耐受細胞中的表達較親本細胞明顯增加，并且可能與腫瘤的臨床進展相關(guān)。
　　第三部分:細胞遷移誘導蛋白在前列腺癌細胞失巢凋亡耐受中的生物學作用和表達調(diào)控機制研究
　　目的：探究CEMIP在前列腺癌細胞失巢凋亡耐受過程中的生物學作用及其表達調(diào)控機制。
　　方法：應用CEMIP的CRISPR/Cas9基因敲除質(zhì)粒和對照質(zhì)

9、粒轉(zhuǎn)染失巢凋亡耐受的PC-3和DU145細胞。采用PE/7-AAD流式細胞術(shù)檢測對照細胞（NC）和干擾了CEMIP表達的細胞（CEMIP-KO）在懸浮培養(yǎng)48小時的凋亡水平，采用Transwell法檢測NC和CEMIP-KO細胞的遷移和侵襲能力。應用生化檢測試劑盒檢測NC和CEMIP-KO細胞丙酮酸、乳酸及ATP水平。應用蛋白質(zhì)免疫印跡實驗檢測NC和CEMIP-KO細胞MMP2、VEGF、PDK4和LDHA的表達情況。將PC-3和DU1

10、45細胞分別懸浮培養(yǎng)1、3、5、7天后用蛋白質(zhì)免疫印跡實驗檢測細胞總AMPKα和p-AMPKα蛋白表達水平；以AMPK通路抑制劑Dorsomorphin處理失巢凋亡耐受的前列腺癌細胞后，用蛋白質(zhì)免疫印跡實驗檢測細胞p-AMPKα、p-GSK3β、β-catenin和CEMIP的蛋白表達水平。用小干擾RNA沉默失巢凋亡耐受的PC-3細胞β-catenin的表達后，蛋白質(zhì)免疫印跡實驗檢測細胞β-catenin和CEMIP的蛋白表達水平；用W

11、nt/β-catenin通路抑制劑XAV939處理失巢凋亡耐受的DU145細胞，以蛋白質(zhì)免疫印跡實驗檢測細胞β-catenin和CEMIP的蛋白表達水平。
　　結(jié)果：用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除失巢凋亡耐受前列腺癌細胞的CEMIP表達后，流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示CEMIP-KO細胞在懸浮培養(yǎng)48小時的凋亡率較NC細胞明顯升高，Transwell實驗結(jié)果提示CEMIP-KO細胞的遷移、侵襲能力較NC細胞顯著下降；生化檢測結(jié)果表明C

12、EMIP-KO細胞的丙酮酸、乳酸和ATP水平較NC細胞明顯降低。蛋白質(zhì)免疫印跡實驗結(jié)果顯示CEMIP-KO細胞MMP2、VEGF、PDK4和LDHA的蛋白表達水平較NC細胞顯著減少。蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果表明前列腺癌細胞p-AMPKα蛋白表達水平隨懸浮培養(yǎng)時間增加而升高，重貼壁后p-AMPKα表達有所下降但仍明顯高于親本細胞，各組總AMPKα的表達無明顯變化；當用Dorsomorphin抑制AMPKα表達后，失巢凋亡耐受前列腺癌細胞的p-G

13、SK3β、β-catenin和CEMIP蛋白表達水平隨p-AMPKα的表達顯著降低。用小干擾RNA或XAV939抑制失巢凋亡耐受細胞的β-catenin后CEMIP蛋白表達水平隨之明顯降低。
　　結(jié)論：CEMIP通過調(diào)控失巢凋亡耐受前列腺癌細胞MMP2和VEGF的蛋白表達影響其失巢凋亡抵抗、遷移和侵襲能力，并通過調(diào)控失巢凋亡耐受前列腺癌細胞PDK4和LDHA的蛋白表達影響其代謝重編程效應。AMPK/GSK3β/β-catenin信