雷公藤紅素與MET抑制劑對(duì)肝癌細(xì)胞的聯(lián)合抗腫瘤作用.pdf

1、目的：
　　肝細(xì)胞肝癌是世界上排名第五常見(jiàn)的腫瘤，每年大約有100萬(wàn)新發(fā)病例。死亡60萬(wàn)例，其發(fā)病率和死亡率均占癌癥的第二位。全球55％的肝癌都發(fā)生在亞洲尤其是中國(guó)。目前肝癌的治療手段繁多，主要是以手術(shù)為主的綜合治療，治療效果一般，肝癌的平均生存期并沒(méi)有大幅度提高。一直以來(lái)由于缺乏抗肝癌的有效藥物，肝癌的治療效果備受限制。因此新的針對(duì)肝癌的藥物研究與開(kāi)發(fā)急需展開(kāi)。
　　天然產(chǎn)物的研究與開(kāi)發(fā)是目前抗腫瘤藥物研究的熱點(diǎn)之一，目前

2、世界上被批準(zhǔn)使用的抗腫瘤藥物70％以上為天然產(chǎn)物或其修飾物。雷公藤紅素主要存在于衛(wèi)矛科植物雷公藤屬植物中，是一個(gè)具有多種生物活性的天然產(chǎn)物。它具有很多顯著的藥理活性，如抗腫瘤活性、免疫抑制活性、抗氧化活性、抗生育活性、抗動(dòng)脈粥樣硬化活性等，是目前很值得關(guān)注的天然活性產(chǎn)物。研究證明雷公藤紅素抗腫瘤活性作用機(jī)制包括:激活熱休克反應(yīng)，抑制蛋白酶體的活化，抑制NF-κB活化及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)MAPKS通路，抑制VEGF介導(dǎo)的增

3、殖、轉(zhuǎn)移、侵襲及毛細(xì)血管生成。雷公藤紅素已經(jīng)被證明能抑制多種腫瘤細(xì)胞系的增殖，但其在肝癌方面的相關(guān)研究甚少。
　　針對(duì)受體酪氨酸激酶的分子靶向抗腫瘤藥物的研發(fā)是目前抗腫瘤藥物研究的另一熱點(diǎn)。受體酪氨酸激酶中的c-MET酪氨酸激酶是HGF的高親和性受體。C-MET和HGF結(jié)合后產(chǎn)生的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及繼發(fā)的生物學(xué)效應(yīng)對(duì)于上皮間充質(zhì)細(xì)胞的交互作用、細(xì)胞的遷徙、入侵、存活、增殖、血管生成、形態(tài)分化、三維管狀結(jié)果的形成都至關(guān)重要。惡性腫瘤中c-M

4、ET和HGF的失調(diào)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)的失調(diào)、腫瘤細(xì)胞的播散、腫瘤的轉(zhuǎn)移和入侵。c-MET和HGF在腫瘤組織表達(dá)相對(duì)增高，并且它的表達(dá)和病人的預(yù)后密切相關(guān)。c-MET被活化會(huì)導(dǎo)致效應(yīng)蛋白如Gab-1、Grb2、Shc、c-Cb1的結(jié)合和磷酸化以及下游信號(hào)蛋白如PI3K、PLC-γ、 STATs、ERK1、ERK2、FAK的活化。PHA-665752是C-MET的小分子抑制劑，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)證明PHA-665752有超過(guò)50％的選擇性激活c-

5、MET，并影響它的信號(hào)轉(zhuǎn)換及效能。在體外實(shí)驗(yàn)中PHA-665752能抑制c-MET的磷酸化和其介導(dǎo)的遷徙、入侵、增殖。PHA-665752能調(diào)節(jié)細(xì)胞的的c-MET信號(hào)轉(zhuǎn)換蛋白ERKs、AKT、FAK。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)證明PHA-665752能抑制肺癌、胃癌、間皮瘤等腫瘤的生長(zhǎng)，但其在肝癌方面的相關(guān)研究甚少。
　　雷公藤紅素和PHA-665752都可能對(duì)肝癌具有抑制作用，而且二者作用的信號(hào)通路有很多交叉，二者聯(lián)合應(yīng)用可能具有協(xié)同增敏效

6、果。另外值得注意的是在小部分腫瘤中MET呈現(xiàn)低表達(dá)，這類(lèi)腫瘤勢(shì)必對(duì)c-MET/HGF靶向治療藥物如PHA-665752耐藥，因此聯(lián)合用藥的研究對(duì)此類(lèi)病人更有意義。
　　方法：
　　我們選取人肝癌Huh7和Bel-7402這兩株亞洲人來(lái)源的細(xì)胞系進(jìn)行研究，來(lái)評(píng)價(jià)雷公藤紅素、PHA-665752及其聯(lián)合應(yīng)用在體外及體內(nèi)對(duì)肝癌的抑制作用。體外實(shí)驗(yàn)中首先用Western Blot實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)Huh7和Bel-7402這兩種細(xì)胞系的M

7、ET、pMET表達(dá)進(jìn)行了研究。利用MTT法，檢測(cè)雷公藤紅素、PHA-665752對(duì)Huh7和Bel-7402這兩種細(xì)胞的半效增殖抑制濃度。利用MTT法，檢測(cè)雷公藤紅素、PHA-665752及其聯(lián)合應(yīng)用體外對(duì)這兩種細(xì)胞的增殖抑制作用。利用小管生成實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)雷公藤紅素、PHA-665752以及其聯(lián)合應(yīng)用的體外抗血管生成作用。利用凋亡caspase3/7分析法，檢測(cè)雷公藤紅素、PHA-665752以及其聯(lián)合應(yīng)用在體外對(duì)人肝癌Huh7和Bel-

8、7402細(xì)胞凋亡的影響。利用Transwell實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)雷公藤紅素、PHA-665752以及其聯(lián)合應(yīng)用對(duì)Huh7和Bel-7402這兩種細(xì)胞的體外遷徙力的影響。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)法，檢測(cè)雷公藤紅素、PHA-665752以及其聯(lián)合應(yīng)用對(duì)Huh7和Bel-7402細(xì)胞周期的影響。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中我們采用Huh7肝癌裸小鼠異種移植模型，評(píng)價(jià)雷公藤紅素、PHA-665752及其聯(lián)合應(yīng)用的體內(nèi)抗腫瘤作用。另外增加Sorafenib治療組，以便更好的評(píng)價(jià)

9、各組的體內(nèi)抗腫瘤效果。
　　結(jié)果：
　　MET、pMET在Huh7人肝癌細(xì)胞系中呈明顯低表達(dá)，在Bel-7402人肝癌細(xì)胞系中呈明顯高表達(dá)，二者具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。
　　雷公藤紅素對(duì)Bel-7402人肝癌細(xì)胞的體外增殖的IC50為0.2670±0.04μm，對(duì)Huh7人肝癌細(xì)胞的體外增殖的IC50為1.0728±0.08μm，PHA-665752對(duì)Bel-7402人肝癌細(xì)胞的體外增殖的IC50為0.08

10、33±0.01μm，對(duì)Huh7人肝癌細(xì)胞的體外增殖的IC50為1.2276±0.04μm。單獨(dú)使用雷公藤紅素對(duì)Bel-7402人肝癌細(xì)胞的增殖抑制作用，與對(duì)Huh7人肝癌細(xì)胞的增殖抑制作用比較，其IC50明顯減少，二者具有顯著差異(P＜0.01)。單獨(dú)使用MET抑制劑PHA-665752對(duì)Bel-7402人肝癌細(xì)胞的增殖抑制作用，與對(duì)Huh7人肝癌細(xì)胞的增殖抑制作用比較，其IC50明顯減少，二者具有顯著差異(P＜0.01)。
　　

11、在體外對(duì)Huh7人肝癌細(xì)胞的增殖抑制實(shí)驗(yàn)中，聯(lián)合用藥比單獨(dú)用藥效果更好，具有顯著差異(P＜0.01)。而雷公藤紅素、PHA-665752單獨(dú)用藥效果差距不大，二者無(wú)明顯差異(P＞0.05)。在體外對(duì)Bel-7402人肝癌細(xì)胞的增殖抑制實(shí)驗(yàn)中，聯(lián)合用藥比單獨(dú)用藥效果更好，具有顯著差異(P＜0.01)。而雷公藤紅素、PHA-665752單獨(dú)用藥效果差距不大，二者無(wú)明顯差異(P＞0.05)。
　　小管生成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:用藥組均能明顯抑制

12、小管生成，與對(duì)照組相比具有顯著差異(P＜0.01)。聯(lián)合用藥比單獨(dú)用藥效果更好，具有顯著差異(P＜0.01)。而雷公藤紅素、PHA-665752單獨(dú)用藥效果差距不大，二者無(wú)明顯差異(P＞0.05)。
　　不同細(xì)胞系中，各用藥組的凋亡caspase3/7活性均明顯增高，與對(duì)照組相比具有明顯差異(P＜0.01)。聯(lián)合用藥組與雷公藤紅素、PHA-665752單獨(dú)用藥組相比，其凋亡caspase3/7活性明顯增高，具有顯著差異(P＜0.0

13、1)。單獨(dú)用藥組之間的凋亡caspase3/7活性差距不大，二者無(wú)明顯差異(P＞0.05)。
　　不同細(xì)胞系中，各個(gè)用藥組均能明顯抑制細(xì)胞的體外遷徙能力，與陽(yáng)性對(duì)照組相比具有明顯差異(P＜0.01)。聯(lián)合用藥組與雷公藤紅素、PHA-665752單獨(dú)用藥組相比，能明顯降低細(xì)胞遷徙力，具有顯著差異(P＜0.01)。PHA-665752組與雷公藤紅素組相比，能明顯降低細(xì)胞遷徙力，具有顯著差異(P＜0.01)。
　　不同細(xì)胞系中，各

14、個(gè)用藥組均能明顯使更多的細(xì)胞停滯在G2/M期，與對(duì)照組相比具有明顯差異(P＜0.01)。聯(lián)合用藥組與雷公藤紅素、PHA-665752單獨(dú)用藥組相比，更多的細(xì)胞停滯在G2/M期，具有顯著差異(P＜0.01)。PHA-665752組與雷公藤紅素組相比，更多的細(xì)胞停滯在G2/M期，二者具有顯著差異(P＜0.01)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:單獨(dú)使用雷公藤紅素、PHA-665752、Sorafenib均能顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)，與對(duì)照組相比具有明顯差異(p＜

15、0.05)。但三個(gè)單獨(dú)用藥組之間無(wú)明顯差異(p＞0.05)。聯(lián)合用藥的抑制腫瘤生長(zhǎng)效果明顯好于各單獨(dú)用藥組，具有明顯差異(p＜0.05)。通過(guò)對(duì)受試動(dòng)物日常行為、二便的觀察，我們發(fā)現(xiàn)，在所使用的劑量?jī)?nèi)，雷公藤紅素、PHA-665752、Sorafenib、及其聯(lián)合用藥均無(wú)無(wú)明顯毒副作用產(chǎn)生。尸檢結(jié)果顯示，受試組胃腸道無(wú)充血及水腫，心、肝、腎等組織無(wú)壞死，質(zhì)地光滑、均勻。對(duì)比各組動(dòng)物體重，各組之間無(wú)明顯差別(p＞0.05)。
　　結(jié)