Akt2是Akt家族中抗氧化應(yīng)激的主要激酶并通過多條信號(hào)途徑抑制過氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡.pdf

1、Akt蛋白激酶(又稱蛋白激酶B)在細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、生理代謝、衰老及疾病和癌癥等細(xì)胞生理病理活動(dòng)的調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用。盡管Akt蛋白激酶家族成員Akt1和Akt2具有高度的氨基酸同源性及類似的蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)，日益增多的研究成果表明Akt1和Akt2在細(xì)胞生理病理活動(dòng)調(diào)控上具有各自特異的功能。
　　 研究表明氧化應(yīng)激是晶狀體上皮廣泛應(yīng)對(duì)的一種環(huán)境壓力，同時(shí)有文獻(xiàn)報(bào)道稱氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的晶狀體上皮細(xì)胞凋亡是非遺傳性白內(nèi)

2、障發(fā)生發(fā)展的病理機(jī)制之一。Akt蛋白激酶作為重要的促細(xì)胞存活因子，其調(diào)控氧化應(yīng)激誘導(dǎo)晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的功能并未被詳細(xì)闡述。本研究的首要目的就是闡明Akt蛋白激酶家族成員調(diào)控氧化應(yīng)激誘導(dǎo)晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。
　　 本論文研究首先確定了Akt蛋白激酶家族三個(gè)成員Akt1、Akt2和Akt3在不同胚胎發(fā)育時(shí)期的小鼠眼球四種組織：視網(wǎng)膜、晶狀體上皮、晶狀體纖維及角膜內(nèi)的發(fā)育表達(dá)模式；其次，本論文研究闡明了Akt1、Akt2和

3、Akt3在成年小鼠眼球四種組織中的分化表達(dá)模式及Akt蛋白激酶在Thr450、Thr308和Ser473位點(diǎn)的磷酸化水平。這一研究表明Akt1是成年小鼠晶狀體組織中顯著高表達(dá)的Akt蛋白激酶家族成員。為了探索Akt1調(diào)控氧化應(yīng)激誘導(dǎo)晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，本研究以人類晶狀體上皮(Human Lens Epithelium，HLE)細(xì)胞為功能研究模型，采用了Akt1特異的shRNA來靶向沉默HLE細(xì)胞中的Akt1并建立了穩(wěn)定的Akt

4、1 knockdown HLE細(xì)胞系，另外也建立了相應(yīng)的對(duì)照Mock knockdown HLE細(xì)胞系。在通過穩(wěn)定體系所產(chǎn)生的50μM過氧化氫對(duì)細(xì)胞進(jìn)行2小時(shí)處理后，與Mockknockdown HLE細(xì)胞相比，Akt1 knockdown HLE細(xì)胞表現(xiàn)出顯著增強(qiáng)抵抗過氧化氫引起細(xì)胞凋亡的能力。對(duì)兩種細(xì)胞顯著差異凋亡率的內(nèi)在分子機(jī)制分析揭示：1)Akt1 shRNA靶向沉默導(dǎo)致HLE細(xì)胞在氧化應(yīng)激下Akt2的上調(diào)和Akt蛋白激酶活性顯

5、著增強(qiáng)；2)顯著增強(qiáng)的Akt蛋白激酶活性調(diào)控下游三條主要的信號(hào)途徑MDM2-p53-Bak，GSK3β-MCL-1及FOXO3A-Bim以增強(qiáng)HLE細(xì)胞抵抗過氧化氫引起細(xì)胞凋亡的能力。
　　 這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Akt2，而并非Akt1，是HLE細(xì)胞中調(diào)控細(xì)胞生理活動(dòng)抵抗氧化應(yīng)激誘導(dǎo)凋亡的主要Akt蛋白激酶家族成員。為了進(jìn)一步證實(shí)此結(jié)論，用Akt2特異的shRNA靶向沉默HLE細(xì)胞及Akt1 knockdown HLE細(xì)胞中的Akt

6、2并分別建立了穩(wěn)定的Akt2knockdown HLE細(xì)胞系與Akt1/2 knockdown HLE細(xì)胞系。用與之前實(shí)驗(yàn)中同等條件的過氧化氫處理細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)Akt2 shRNA靶向沉默能顯著增強(qiáng)兩種細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)凋亡的敏感性。與各自對(duì)照的Mock knockdown HLE細(xì)胞相比，過氧化氫處理使Akt2knockdown HLE細(xì)胞和Akt1/2 knockdown HLE細(xì)胞的凋亡率顯著上升。另外，在Akt2 knockdow

7、n HLE細(xì)胞與Akt1/2 knockdown HLE細(xì)胞中，過氧化氫處理導(dǎo)致Akt蛋白激酶控制的三條主要信號(hào)途徑表現(xiàn)出相似的變化。為了更進(jìn)一步確定Akt2抵抗氧化應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要功能，在HLE細(xì)胞中轉(zhuǎn)染了Akt2的表達(dá)質(zhì)粒，過氧化氫處理細(xì)胞后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Akt2的過表達(dá)能顯著降低氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率。
　　 總結(jié)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究首次指出了Akt1 shRNA靶向沉默誘導(dǎo)Akt2代償性上調(diào)及Akt蛋白激酶活性增