定量多肽組學(xué)研究過氧化氫誘導(dǎo)的釀酒酵母細胞凋亡.pdf

1、基于質(zhì)譜技術(shù)的多肽組學(xué)可以用來研究生物體內(nèi)的小分子多肽。多肽組學(xué)方法在發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物、蛋白酶和肽酶底物及調(diào)控蛋白水解過程中具有重要意義。
　　細胞凋亡是由基因調(diào)控的高度有序的細胞程序性死亡過程，對多細胞生物的發(fā)育和維持自身平衡至關(guān)重要?；钚匝跏羌毎蛲龅闹匾{(diào)控者，但其誘導(dǎo)細胞凋亡的信號通路尚未完全闡述。迄今為止，Yca1p是酵母中發(fā)現(xiàn)的唯一類似哺乳動物caspase蛋白的同源物。YCA1在調(diào)控酵母細胞凋亡中具有的重要作用已經(jīng)被證

2、實，但其分子機制還有待進一步研究。
　　為了進一步研究活性氧(ROS)和YCA1在細胞凋亡中的機理，本實驗以野生型釀酒酵母BY4741和突變株△yca1為實驗材料，選用過氧化氫(H2O2)作為氧化壓力，用不同濃度H2O2分別處理野生型釀酒酵母細胞BY4741和突變株△yca1，菌落計數(shù)法和AnnexinⅤ/PI雙染法分別檢測酵母的存活率和凋亡率，并采用定量多肽組學(xué)的方法檢測凋亡過程中細胞內(nèi)多肽的變化，以期發(fā)現(xiàn)YCA1在凋亡過程中的

3、分子機制。實驗結(jié)果如下:
　　1.菌落計數(shù)法和AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法檢測結(jié)果顯示，當(dāng)用不同濃度的過氧化氫處理野生型釀酒酵母BY4741和突變株△yca1時，隨著濃度的增加，存活率均不斷地下降，凋亡率均不斷地增加。且野生型BY4741存活率均低于突變株△yca1，凋亡率均高于突變株△yca1。
　　2.用2mM H2O2處理野生型BY4741，檢測到912條多肽，有262條肽發(fā)生顯著變化，歸屬于121個蛋白前體

4、。檢測到的差異表達肽有48％位于前體蛋白的N或C端。有5種前體蛋白能夠產(chǎn)生6條以上的肽，分別是甘油醛-3-磷酸脫氫酶3、磷酸甘油酸激酶、果糖-二磷酸醛縮酶、60S酸性核糖體蛋白P1-α、熱休克蛋白60。來自于這5種蛋白產(chǎn)生的肽既有上調(diào)的，也有下調(diào)的。
　　3.用2mM H2O2處理突變株△yca1，總共鑒定出490條多肽，有170條肽發(fā)生顯著變化，歸屬于87個蛋白前體。其中兩條上調(diào)的肽gQDDLGkGDTEES、tPGAATIkP

5、TVE分別來自于超氧化物歧化酶[Cu-Zn]、過氧化物酶TSA1。50％差異表達肽位于前體蛋白的N或C端。絕大多數(shù)的肽來源于未表征的蛋白質(zhì)YNL208W、磷酸甘油酸激酶、延伸因子1-α、輔助伴侶蛋白SBA-1。
　　4.通過比較2mM H2O2處理野生型釀酒酵母BY4741和突變株△yca1后的多肽，發(fā)現(xiàn)有300條相同的肽，有182條肽發(fā)生變化，其中在兩種菌株均發(fā)生變化的有42條肽，只在在野生型BY4741發(fā)生顯著變化的有45條肽