SLC38A3通過激活A(yù)kt信號(hào)通路誘導(dǎo)EMT促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的轉(zhuǎn)移.pdf

1、肺癌是臨床常見的惡性腫瘤之一，其死亡率是惡性腫瘤總死亡率的1/4，高居于首位。隨著全球環(huán)境日益惡化，許多城市出現(xiàn)霧霾殺手，肺癌的發(fā)病率更是持續(xù)增長(zhǎng)，且有明顯的年輕化趨勢(shì)，而且肺癌極容易發(fā)生轉(zhuǎn)移。肺癌按照臨床特征分為小細(xì)胞肺癌(Small cell carcinoma, SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(Non-small-cell carcinoma，NSCLC)，前者僅占15％，而5年生存率極低的非小細(xì)胞肺癌占了總肺癌的85％。非小細(xì)胞型肺癌

2、極易轉(zhuǎn)移到一些血供豐富的重要組織器官，如腦、肝、脊柱等。腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)極為復(fù)雜的過程，目前有研究認(rèn)為上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用。EMT是一個(gè)多轉(zhuǎn)錄因子參與的復(fù)雜過程，參與其中的信號(hào)通路主要有依賴Smad和非依賴Smad的TGF-β通路、AKT信號(hào)通路、STAT3信號(hào)通路等等。將EMT的機(jī)制研究清楚，可以通過這些信號(hào)通路阻斷EMT進(jìn)程，從而防止

3、腫瘤轉(zhuǎn)移。
　　SLC38家族是人溶質(zhì)載體家族(Solute Carrier Family)中第38號(hào)家族，是一類Na耦聯(lián)中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白家族，共有11個(gè)成員，其中SLC38A3主要位于細(xì)胞膜上，可依賴Na+和H+進(jìn)行雙向跨膜運(yùn)輸，主要轉(zhuǎn)運(yùn)谷氨酰胺、組氨酸、丙氨酸、天冬酰胺等。由于腫瘤細(xì)胞具有快速、無(wú)限增長(zhǎng)的特性，其對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求也不同于正常細(xì)胞。目前研究認(rèn)為，許多腫瘤細(xì)胞可以通過改變代謝方式和/或增加對(duì)谷氨酰胺的依賴性從而

4、為自身的生長(zhǎng)提供原料。SLC38A3是一種谷氨酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其特殊的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)方式提示它在氮代謝和傳遞過程中具有重要作用。了解SLC38A3在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)情況及其與肺癌的相關(guān)性具有重要的臨床臨床意義，明確其在非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)理可為進(jìn)一步尋找非小細(xì)胞肺癌治療的靶點(diǎn)提供依據(jù)。
　　目的:
　　1.了解溶質(zhì)載體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SLC38A3在非小細(xì)胞肺腺癌腫瘤組織和非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株中的表達(dá)情況。
　　2.研究

5、溶質(zhì)載體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SLC38A3促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制。
　　方法:
　　組織芯片免疫組化檢測(cè)臨床非小細(xì)胞肺癌組織中SLC38A3的表達(dá);WesternBlot檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株中SLC38A3的表達(dá);網(wǎng)站分析SLC38A3表達(dá)與肺癌病人生存期的關(guān)系;構(gòu)建肺癌細(xì)胞Hcc827的SLC38A3過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系;質(zhì)譜分析技術(shù)分析SLC38A3過表達(dá)后細(xì)胞內(nèi)其轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸的變化;Western Blot檢測(cè)SLC38A3過表達(dá)

6、對(duì)EMT標(biāo)志蛋白的變化;對(duì)細(xì)胞形態(tài)觀察、劃痕實(shí)驗(yàn)和transwell實(shí)驗(yàn)等研究過表達(dá)SLC38A3對(duì)非小細(xì)胞肺癌生物學(xué)行為的影響;進(jìn)一步通過Western Blot檢測(cè)過表達(dá)SLC38A3對(duì)腫瘤細(xì)胞EMT信號(hào)通路的影響。
　　結(jié)果:
　　我們用組織芯片檢測(cè)了75例臨床肺腺癌病人腫瘤組織中SLC38A3的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與癌旁對(duì)照組織相比，所有腫瘤組織中SLC38A3的表達(dá)均明顯上調(diào)，差別有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.0088

7、)，并且SLC38A3在原位肺癌病人癌組織中的表達(dá)量灰度值125.226±20.3725，而在Ⅲ級(jí)肺癌病人體內(nèi)表達(dá)量灰度值為184.7093±17.6235，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.0097)。通過Kaplan Meier plotter網(wǎng)站分析發(fā)現(xiàn):SLC38A3低表達(dá)組肺癌病人100個(gè)月生存概率為0.553，200個(gè)月生存概率為0.357，而高表達(dá)組100個(gè)月生存率不到0.4，到200個(gè)月生存概率已趨近于0。成功構(gòu)建過表達(dá)SLC3

8、8A3穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系后，Western Blot、細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SLC38A3過表達(dá)的非小細(xì)胞肺癌Hcc827細(xì)胞株EMT上皮表型標(biāo)志蛋白E-Cadherin的表達(dá)明顯下降，而EMT間質(zhì)表型標(biāo)志物N-Cadherin的表達(dá)卻明顯升高。劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SLC38A3過表達(dá)后經(jīng)48h，劃痕閉合為原來的58.4％，而對(duì)照組僅閉合了40％，差異有顯著意義。Transwell實(shí)驗(yàn)證明了SLC38A3過表達(dá)組細(xì)胞透過生物膜的細(xì)胞數(shù)為對(duì)照組的三倍。質(zhì)譜

9、分析技術(shù)發(fā)現(xiàn)SLC38A3過表達(dá)后由其轉(zhuǎn)運(yùn)谷氨酰胺和組氨酸在細(xì)胞內(nèi)含量分別降低了71.8％、80.8％。實(shí)驗(yàn)室前期檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SLC38A3過表達(dá)后，p-AKT(Thr308)表達(dá)上調(diào)，下游的p-GSK3β、β-catenin、snail也上調(diào)。Snail是EMT一個(gè)非常重要的效應(yīng)分子。在此之后，我們加入AKT抑制劑MK22065um/L處理5小時(shí)阻斷這一信號(hào)通路后，效應(yīng)分子snail下調(diào);同樣濃度處理96h后，SLC38A3過表達(dá)組細(xì)胞形

10、態(tài)變得規(guī)則致密，而未經(jīng)抑制劑處理的過表達(dá)組依然保持松散梭形形態(tài)。此外，Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SLC38A3過表達(dá)后p-mTORC1及其下游的p-S6K1表達(dá)均升高，而抑制mRNA翻譯的4EBP-1下調(diào)。綜上所述，外源性高表達(dá)SLC38A3可激活A(yù)KT信號(hào)通路誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌發(fā)生EMT。
　　結(jié)論:
　　1.SLC38A3在臨床非小細(xì)胞型肺癌病人癌組織中的表達(dá)明顯高于在癌旁組織的表達(dá)，且與肺癌病人生存期負(fù)相關(guān)。