小分子化合物木脂素VB6通過激活JNK信號通路誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和自噬的機(jī)制研究.pdf

1、[研究背景]
　　 惡性腫瘤的發(fā)病率越來越高，且涉及機(jī)體各個系統(tǒng)，成為危害人類健康的常見病。目前，惡性腫瘤的治療仍然以手術(shù)治療為主，輔以化療、放療、生物治療的綜合性治療。近年來在腫瘤手術(shù)及放化療不斷發(fā)展的同時，分子靶向治療，腫瘤免疫治療也飛速發(fā)展。隨著臨床治療的多元化，腫瘤患者的臨床獲益得到改善，生存時間明顯延長。但是，在化療的過程中有相當(dāng)部分患者因?yàn)閷熕幬锬退幓蛘唠y以耐受藥物的毒副反應(yīng)而不能維持長期緩解，尋求高效低毒的藥物

2、仍是腫瘤治療研究的一個重要方向。
　　 黃荊子乙酸乙酯提取物(Evn-50)來源于黃荊子(FructusViticisNegundo)，其為馬鞭草科牡荊屬植物黃荊(VitexnegundoL.)的果實(shí)，黃荊子性溫，味苦，具有除痰，行氣，止痛，退熱，治療咳嗽，哮喘的功能，中醫(yī)主要用于治療慢性支氣管炎，對咳，痰，喘有明顯療效[1]。Evn-50是黃荊子的主要毒性成分，屬于新木脂素類化合物，同其他植物類木脂素化合相比，不需經(jīng)過腸道細(xì)菌

3、轉(zhuǎn)化成動物木脂素腸內(nèi)酯、腸二醇。本課題組前期對Evn-50抗惡性腫瘤的作用進(jìn)行了較系統(tǒng)的體外和體內(nèi)的試驗(yàn)研究，體外研究發(fā)現(xiàn)Evn-50具有較廣譜的抗惡性腫瘤作用，在體外對多種惡性腫瘤細(xì)胞系諸如MCF7、ZR-75-1、MDA-MB-435S、MDA-MB-231、LNCaP、PC-3、COC1細(xì)胞均有明顯的增殖抑制作用，荷瘤裸鼠模型的研究也表明，Evn-50同樣具有顯著的抑制乳腺癌，前列腺癌，肝癌模型和子宮頸癌生長的作用。研究發(fā)現(xiàn)Evn

4、-50通過顯著上調(diào)Bax/Bcl-2的比值，促進(jìn)Bax的表達(dá)，抑制Bcl-2的表達(dá)而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，天然小分子化合物Evn-50對多種惡性細(xì)胞具有明確的誘導(dǎo)凋亡作用。
　　 VB6又名6-羥基-4-(4-羥基-3-甲氧基苯基)3-羥甲基-7-甲氧基-3，4-二氫(3R，4S)-2-醛基萘，是從Evn-50化合物中分離純化出來的單體分子。本課題組繼續(xù)對VB6進(jìn)行抗腫瘤活性研究，探討VB6體外體內(nèi)抗腫瘤作用及其可

5、能機(jī)制，進(jìn)一步從分子水平明確VB6對腫瘤相關(guān)信號通路的影響，為后續(xù)新型抗腫瘤藥物的研發(fā)奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 [研究目的]
　　 篩選敏感細(xì)胞株，研究VB6在體外對腫瘤細(xì)胞的增殖抑制及促進(jìn)凋亡、自噬作用，并探討其分子機(jī)制，明確其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡、自噬的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。同時建立大腸癌細(xì)胞株RKO裸鼠荷瘤模型，研究VB6的體內(nèi)抗腫瘤作用。
　　 [研究方法]
　　 1.倒置顯微鏡觀察VB6處理MCF-7、RK

6、O細(xì)胞后的形態(tài)學(xué)改變；
　　 2.采用MTT法測定VB6對不同細(xì)胞株的生長抑制率，篩選敏感細(xì)胞株；
　　 3.透射電鏡觀察VB6處理MCF-7、RKO細(xì)胞后細(xì)胞凋亡、自噬形態(tài)改變；
　　 4.流式細(xì)胞儀分析凋亡細(xì)胞百分比及細(xì)胞周期改變；
　　 5.WesternBlot法檢測VB6處理MCF-7、RKO細(xì)胞后JNK、p-JNK、c-Jun、p-c-Jun、Bcl-2、Bax、p-Bcl-2、Caspase

7、-3、PARP、Beclin-1、LC3B的表達(dá)變化；
　　 6.Balb/c-nu雌性裸鼠荷瘤，腹腔給藥觀察VB6的體內(nèi)抗腫瘤作用。
　　 [研究結(jié)果]
　　 1.VB6對MCF-7和RKO細(xì)胞增殖抑制效果隨著藥物作用時間延長和濃度增加而加強(qiáng)
　　 應(yīng)用倒置顯微鏡觀察VB6對MCF-7和RKO細(xì)胞增殖的影響，經(jīng)過5μMVB6作用不同時間后，兩株細(xì)胞均可見細(xì)胞質(zhì)減少，細(xì)胞體縮小，多數(shù)細(xì)胞由多邊形變成橢圓形

8、或者圓形，細(xì)胞伸展不良，逐漸與周圍的細(xì)胞脫離，還有明顯的空泡化，出現(xiàn)大量的細(xì)胞碎片，且形態(tài)改變隨作用時間的延長而變得明顯，不同濃度VB6對MCF-7和RKO細(xì)胞分別作用24、12小時后發(fā)現(xiàn)兩株細(xì)胞產(chǎn)生同樣的形態(tài)改變，高濃度更明顯。結(jié)果表明VB6對MCF-7和RKO細(xì)胞增殖都有較好的抑制作用，并且抑制效果表現(xiàn)出時間和濃度依賴性。
　　 2.不同類型的細(xì)胞株對VB6的敏感性不同
　　 人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株IC50為1.4

9、6μM，人白血病K562細(xì)胞株IC50為1.32μM，人大腸癌RKO、SW480、SW620細(xì)胞株IC50分別為2.85μM、4.2μM、3.36μM，人膀胱癌HTB-95637、RT4細(xì)胞株IC50分別為2.85μM、3.92μM，人骨肉瘤MG63細(xì)胞株IC50為2.01μM，人肺癌H1975細(xì)胞株IC50為4.24μM，人肝癌HepG2細(xì)胞株IC50為12.37μM，人胰腺癌Panc-1細(xì)胞株IC50為7.62μM，人胃癌細(xì)胞株AG

10、S、MKN-28細(xì)胞株IC50分別為2.34μM、7.08μM，人前列腺癌PC-3細(xì)胞株IC50為1.71μM。
　　 3.VB6誘導(dǎo)MCF-7、RKO細(xì)胞出現(xiàn)凋亡和自噬形態(tài)改變
　　 5μMVB6作用MCF-7、RKO細(xì)胞24h后透射電鏡觀察結(jié)果顯示：細(xì)胞胞體體積縮小，胞質(zhì)濃縮，線粒體空泡化，核內(nèi)染色質(zhì)濃縮，形成染色質(zhì)塊，核碎片明顯，兩株細(xì)胞都出現(xiàn)了凋亡性死亡；透射電鏡下除見到凋亡改變外，還可觀察到細(xì)胞自噬的特征變化，

11、可見雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬泡積聚及膨脹的線粒體。
　　 4.VB6誘導(dǎo)MCF-7、RKO細(xì)胞凋亡呈濃度依賴性
　　 流式結(jié)果顯示：VB6可以引起MCF-7和RKO細(xì)胞凋亡，并且細(xì)胞凋亡率呈濃度依賴性。MCF-7細(xì)胞經(jīng)過1、2μMVB6處理細(xì)胞24h后，細(xì)胞的凋亡率分別是(6.15±1.07)％、(11.06±0.5)％，結(jié)果與對照組相比(p<0.05)。
　　 RKO細(xì)胞對照組凋亡率為2.51％，而經(jīng)過1、5μMVB6

12、處理細(xì)胞12h后，細(xì)胞凋亡率分別為10.75％、13.32％，結(jié)果同對照組相比均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05)。
　　 VB6聯(lián)合應(yīng)用JNK特異性抑制劑SP600125處理MCF-7和RKO細(xì)胞相應(yīng)時間后，兩種細(xì)胞凋亡率明顯受到抑制，同單用VB6相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 5.VB6可以引起MCF-7細(xì)胞G2/M期阻滯，并且細(xì)胞周期阻滯具有濃度依賴性
　　 應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測VB6對MCF-7和RKO細(xì)胞周

13、期的影響，1，2μMVB6作用MCF-7細(xì)胞12小時G2/M期分別為17.51％、23.06％，明顯高于正常對照細(xì)胞的4.89％，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)；且2μMVB6作用MCF-7細(xì)胞24小時G2/M期細(xì)胞比率增加到50.24％。而流式結(jié)果分析，VB6對RKO細(xì)胞周期分布未見明顯影響。結(jié)果表明異VB6可以引起MCF-7細(xì)胞G2/M期阻滯，并且細(xì)胞周期阻滯具有時間和濃度依賴性。
　　 6.VB6通過引起B(yǎng)cl-2

14、和Bax表達(dá)變化，Caspase-3及PARP裂解激活，JNK通路活化誘導(dǎo)MCF-7和RKO細(xì)胞凋亡
　　 WesternBlot結(jié)果顯示：VB6誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7和大腸癌RKO細(xì)胞凋亡伴有Bcl-2和Bax相對比例的改變，RKO細(xì)胞Caspase-3及PARP裂解激活；VB6能以濃度和時間依賴性方式上調(diào)MCF-7和RKO細(xì)胞p-JNK、p-c-Jun、p-Bcl-2蛋白質(zhì)的表達(dá)水平而引起細(xì)胞凋亡。VB6聯(lián)合應(yīng)用JNK特異性抑

15、制劑SP600125處理MCF-7和RKO細(xì)胞后明顯抑制p-JNK、p-e-Jun、p-Bcl-2蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，細(xì)胞凋亡比率受到明顯抑制。
　　 7.VB6誘導(dǎo)MCF-7和RKO細(xì)胞自噬同自噬蛋白Beclin-1、LC3B有關(guān)
　　 Beclin-1的激活可以促進(jìn)自噬的發(fā)生，LC3B是酵母Atg8的同源物，是哺乳動物細(xì)胞自噬體形成的可靠標(biāo)志。通過Westernblot方法檢測，結(jié)果顯示VB6可上調(diào)兩株細(xì)胞Beclin

16、-1的表達(dá)，同時伴隨有LC3B的裂解，呈時間依賴性。
　　 8.VB6對荷瘤裸鼠移植瘤生長的影響
　　 VB6對RKO細(xì)胞裸鼠移植瘤體積增長有抑制作用，同PBS組比較差異有顯著性(p<0.05)，但VB6各濃度組間RKO細(xì)胞裸鼠移植瘤體積無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；同時，各濃度VB6組裸鼠體重、精神狀態(tài)及尸檢時裸鼠肝臟、肺臟、心臟、腸等重要臟器顏色、形狀未見明顯異常，實(shí)驗(yàn)劑量下VB6對裸鼠未見明顯毒副作用。
　　 [結(jié)論]

17、r>　　 1.VB6能有效抑制多種人源性腫瘤細(xì)胞增殖，具有明顯的細(xì)胞毒性作用，但細(xì)胞株類型不同，其敏感性不同；
　　 2.VB6能誘導(dǎo)MCF-7和RKO細(xì)胞凋亡，并且細(xì)胞凋亡率具有時間和濃度依賴性。能將MCF-7細(xì)胞周期阻滯在G2/M期；
　　 3.VB6能誘導(dǎo)MCF.7和RKO細(xì)胞自噬性死亡；
　　 4.VB6通過顯著上調(diào)Bax/Bcl-2的比值，促進(jìn)Bax的表達(dá)，抑制Bcl-2的表達(dá)而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡；