TRAF2和RIP1介導(dǎo)的JNK激活誘導(dǎo)的自噬存活通路降低TRAIL誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的機制研究.pdf

1、目的:本課題以體外培養(yǎng)的多種腫瘤細胞為研究對象，通過TRAIL進行干預(yù)，觀察TRAIL能否誘導(dǎo)腫瘤細胞自噬以及自噬在TRAIL誘導(dǎo)腫瘤細胞自噬中的作用，并從細胞信號傳導(dǎo)通路及蛋白水平探討TRAIL誘導(dǎo)自噬以及自噬對不同腫瘤細胞增殖、凋亡影響的作用機制。為增強TRAIL的療效以及逆轉(zhuǎn)TRAIL的耐藥腫瘤奠定實驗理論基礎(chǔ)。
　　 方法:應(yīng)用TRAIL處理體外培養(yǎng)的UM-UC-3、A549以及PC-3，然后應(yīng)用LDH檢測TRAIL細胞

2、毒性，應(yīng)用Westernblot檢測自噬相關(guān)蛋白，通過熒光顯微鏡檢測自噬體的變化明確TRAIL能否誘導(dǎo)自噬。然后應(yīng)用自噬抑制劑WTM、CQ以及沉默自噬關(guān)鍵基因ATG7以及Beclin-1抑制自噬觀察對TRAIL誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的影響，探明自噬在TRAIL誘導(dǎo)凋亡中的作用。應(yīng)用Western blot檢測凋亡信號通路蛋白Caspase8、Caspase3以及PARP的變化;應(yīng)用自噬抑制劑CQ抑制自噬檢測對TRAIL誘導(dǎo)死亡復(fù)合體的影響，應(yīng)

3、用GST Pull Down檢測死亡復(fù)合體蛋白Caspase8、FADD以及RIP1表達的變化，明確自噬對凋亡和死亡復(fù)合體的影響。應(yīng)用JNK抑制劑SP、NF-kB抑制劑IKBKB Inhibitor抑制JNK及NF-kB信號通路，觀察其對自噬以及TRAIL誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的影響，應(yīng)用Western blot檢測自噬相關(guān)蛋白LC-3B以及凋亡信號通路蛋白Caspase8、Caspase3以及PARP的變化，探明調(diào)節(jié)自噬的信號通路。應(yīng)用TR

4、AIL處理體外培養(yǎng)的腫瘤細胞UM-UC-3以及A549，然后應(yīng)用Western blot檢測Bcl-2家族蛋白的表達，通過免疫共沉淀(Co-IP)檢測Beclin1-Bcl2/Bcl-xl復(fù)合體的變化;以及抑制JNK和NF-kB通路對上述蛋白變化的影響，明確TRAIL誘導(dǎo)自噬的可能機制。應(yīng)用JNK抑制劑SP、自噬抑制劑WTM抑制JNK及自噬信號通路，然后應(yīng)用Western blot檢測對抗凋亡蛋白家族表達的影響;然后再應(yīng)用自噬抑制劑CQ

5、、CathepsinB、溶酶體抑制劑MG-132、凋亡抑制劑z-VAD以及JNK抑制劑SP，觀察其對TRAIL誘導(dǎo)的抗凋亡蛋白家族降解的影響，探明自噬對抗凋亡蛋白降解的影響。最后沉默RIP1以及TRAF2，觀察其對自噬水平的影響以及對TRAIL誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的影響，應(yīng)用LDH檢測腫瘤細胞死亡以及應(yīng)用Western blot檢測自噬蛋白LC-3Ⅱ表達的變化，探明JNK激活介導(dǎo)的TRAIL誘導(dǎo)自噬的上游信號通路。
　　 結(jié)果:TR

6、AIL可以誘導(dǎo)膀胱腫瘤細胞UM-UC-3、肺癌細胞A549以及前列腺癌細胞PC-3自噬;主要表現(xiàn)為LC-3Ⅱ表達增加、“自噬潮”的形成以及自噬體的顯著增加。TRAIL誘導(dǎo)的自噬對腫瘤細胞起保護作用，無論是應(yīng)用藥物抑制劑3MA、WTM或CQ還是沉默自噬關(guān)鍵基因ATG7或Beclin-1抑制自噬，均能顯著增強TRAIL的細胞毒性。自噬可以抑制TRAIL誘導(dǎo)的凋亡信號通路，抑制自噬可增強TRAIL誘導(dǎo)的細胞凋亡，以及死亡復(fù)合體的形成。抑制JN

7、K可以抑制自噬，進而明顯增強TRAIL誘導(dǎo)的細胞毒性。TRAIL誘導(dǎo)的自噬主要通過Bcl-xl的降解以及 Bcl-xl-Beclin1復(fù)合體的分離來實現(xiàn)的;而抑制JNK可以抑制Bcl-xl的降解并可以促進Bcl-xl-Beclin1復(fù)合體的重新結(jié)合。JNK介導(dǎo)的自噬參與了抗凋亡蛋白的降解，抑制JNK或抑制自噬均能顯著促進抗凋亡蛋白cIAP1、cIAP2、XIAP以及c-FLIP的降解。RIP1以及TRAF2調(diào)節(jié)JNK激活誘導(dǎo)自噬的產(chǎn)生。